Sérine ADP

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 3200 (2023) Citer cet article

1032 accès

11 Altmétrique

Détails des métriques

Dans la réponse aux dommages à l'ADN des mammifères, la signalisation de l'ADP-ribosylation est d'une importance cruciale pour marquer les sites de dommages à l'ADN ainsi que pour recruter et réguler les facteurs de réparation. Plus précisément, le complexe PARP1: HPF1 reconnaît l'ADN endommagé et catalyse la formation de marques d'ADP-ribosylation liées à la sérine (mono-Ser-ADPr), qui sont étendues en polymères ADP-ribose (poly-Ser-ADPr) par PARP1 seul. Poly-Ser-ADPr est inversé par PARG, tandis que le terminal mono-Ser-ADPr est supprimé par ARH3. Malgré son importance et sa conservation évolutive apparente, on sait peu de choses sur la signalisation de l'ADP-ribosylation chez les animaux non mammifères. La présence de HPF1, mais l'absence d'ARH3, dans certains génomes d'insectes, y compris les espèces de drosophiles, soulève des questions concernant l'existence et l'inversion de la sérine-ADP-ribosylation chez ces espèces. Ici, nous montrons par protéomique quantitative que Ser-ADPr est la principale forme d'ADP-ribosylation dans la réponse aux dommages à l'ADN de Drosophila melanogaster et dépend du complexe dParp1:dHpf1. De plus, nos investigations structurales et biochimiques révèlent le mécanisme d'élimination du mono-Ser-ADPr par Drosophila Parg. Collectivement, nos données révèlent que la Ser-ADPr médiée par PARP: HPF1 est une caractéristique déterminante du DDR chez Animalia. La conservation frappante au sein de ce royaume suggère que les organismes qui ne portent qu'un ensemble central d'enzymes métabolisant l'ADP-ribosyle, tels que la drosophile, sont des organismes modèles précieux pour étudier le rôle physiologique de la signalisation Ser-ADPr.

L'ADP-ribosylation (ADPr) est une modification post-traductionnelle des protéines qui implique le transfert de fragments ADP-ribose du NAD+ sur une protéine cible. Il est impliqué dans la régulation d'un large éventail de processus cellulaires, tels que la réparation de l'ADN, la régulation transcriptionnelle, l'immunité et le métabolisme microbien, entre autres1,2,3,4. Les unités ADP-ribose peuvent être attachées à une variété de chaînes latérales d'acides aminés, entre autres avec des fonctionnalités acides (Glu/Asp), basiques (Arg/Lys), hydroxyle (Ser/Tyr) et thiol (Cys)2,5. Certains auteurs, tels que PARP1, PARP2 et tankyrase1/2 (également appelés PARP5a/b) peuvent étendre la modification initiale connue sous le nom de mono(ADP-ribosylation) (MARylation) et créer des polymères ADP-ribose linéaires ou ramifiés appelés poly(ADP -ribosylation) (PARylation)6,7,8.

La liaison de PARP1/2 induit la protéine ADPr dépendante de PARP1/2 au niveau des cassures de l'ADN, ce qui donne lieu à des signaux ADPr qui activent et contrôlent une variété de mécanismes de réponse aux dommages de l'ADN (DDR) nécessaires à la décompression de la chromatine et au recrutement de facteurs de réparation4 ,9. Des études antérieures ont montré que PARP1 et PARP2 catalysent la modification du glutamate/aspartate in vitro10, tandis que l'analyse par spectrométrie de masse a révélé que la sérine-ADPr est le principal résidu modifié par l'ADPr lors de dommages à l'ADN dans les cellules humaines11,12,13,14. Cet écart a été résolu avec la découverte de la protéine auxiliaire, l'histone PARylation factor 1 (HPF1)11,15, qui complète le site actif de PARP1/2 en contribuant à la liaison au substrat et aux résidus catalytiques16,17,18. De plus, le complexe PARP1/2:HPF1 est également responsable de la modification moins connue des résidus tyrosine19,20.

ADPr est très dynamique et doit être étroitement régulé en raison de la dépense énergétique élevée associée. Par conséquent, une fois qu'une réponse cellulaire appropriée a été obtenue, la signalisation ADPr cesse et les unités ADP-ribose utilisées sont recyclées par des effaceurs spécialisés qui convertissent l'ADP-ribose en d'autres nucléotides, notamment l'ATP et le NAD+21. La principale enzyme responsable de la dégradation de la majeure partie des chaînes PAR est la poly(ADP-ribose)glycohydrolase (PARG), qui hydrolyse la liaison acétal dans le polymère ADP-ribose, mais ne peut pas inverser la liaison protéine-ribose22,23,24. Dans les cellules humaines, cette réaction spécifique, l'élimination de la Ser-ADPr, est réalisée par la (ADP-ribosyl)hydrolase 3 (ARH3)23,25.

Notamment, l'interaction de l'établissement d'ADPr par les complexes PARP1 / 2: HPF1 avec l'élimination de la modification par étapes par PARG et ARH3 fait partie intégrante du contrôle de la réparation de l'ADN et de la régulation de la structure de la chromatine8,15,26,27,28. Récemment, il a également été démontré que ces composants sont des déterminants critiques de la réponse aux inhibiteurs de PARP cliniquement pertinents27,29,30. Malgré l'importance de la signalisation Ser-ADPr chez les mammifères, sa pertinence pour Animalia en dehors de la lignée des mammifères reste insaisissable. Alors que les PARP et l'ADPr ont déjà été étudiés chez Drosophila melanogaster31, la nature du résidu majoritairement modifié par l'ADPr dans cet organisme modèle reste à établir. Drosophila Parp (dParp) et Parg (dParg) se sont également avérés impliqués dans plusieurs fonctions biologiques telles que la DDR32, la régulation transcriptionnelle33,34 et le remodelage de la chromatine35,36,37,38,39 entre autres. De plus, dParp s'est avéré être un gène essentiel chez la drosophile, la délétion étant létale lors de la transition du stade larvaire au stade nymphal34,40. L'expression de mutations de perte de fonction de dParg induit également un phénotype larvaire létal à 25 ° C. Cependant, 25 % des mouches mutantes ont pu passer au stade adulte à 29 °C, tout en présentant un phénotype de neurodégénérescence progressive lié à l'accumulation de PAR dans les neurones41. De plus, la manipulation des niveaux d'expression des gènes dParp ou dParg a conduit à des phénotypes modifiés dans des modèles de mouches de maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson42,43, la maladie d'Alzheimer44 et la sclérose latérale amyotrophique45. Cependant, on ne sait pas si dParp coopère avec dHpf1 et, si c'est le cas, si la modification résultante est principalement localisée sur les résidus sérine.

Nous rapportons ici l'existence d'un système de signalisation Ser-ADPr abondant et conservé chez la drosophile catalysé par dParp:dHpf1 avec une fonctionnalité largement comparable à la signalisation ADPr induite par DDR chez l'homme. Nous montrons en outre que, bien que la drosophile soit dépourvue d'ARH3, il existe une adaptation évolutive frappante de dParg qui confère une équivalence fonctionnelle à la fois au PARG humain et à l'ARH3. La conservation et la simplicité relative du Ser-ADPr chez la drosophile - avec un seul PARP associé à la réparation de l'ADN et une hydrolase opposée - font des mouches des fruits un modèle attrayant pour une étude plus approfondie de cette modification importante.

À ce jour, la Ser-ADPr n'a été étudiée que chez les vertébrés. Notre analyse phylogénétique a révélé que HPF1 a été conservé dans pratiquement toutes les métazoaires, y compris les branches primitives telles que les coraux et les éponges, ainsi que les organismes connus pour leurs fréquentes pertes de gènes tels que D. melanogaster et Caenorhabditis elegans (Fig. 1 et données supplémentaires 1). De plus, HPF1 se trouve dans de nombreux protozoaires. De même, ARH3 est largement distribué parmi les Metazoa, mais ne peut être trouvé que sporadiquement dans les Amoebazoa et Alveolata (Données supplémentaires 1). L'apparition de ces deux gènes cruciaux pour l'établissement et l'élimination de Ser-ADPr dans l'évolution précoce du règne Animalia le suggère fortement comme l'origine de cette variation de signalisation de l'ADP-ribosylation. Étonnamment, notre analyse a révélé que l'ARH3 est absent de plusieurs lignées eucaryotes, notamment les nématodes, les lépidoptères et la plupart des diptères, y compris toutes les espèces de drosophiles. Cependant, ces espèces déficientes en ARH3 conservent toujours le principal dégradeur de PAR PARG ainsi que HPF1. Ces résultats suggèrent que le cycle Ser-ADPr chez la drosophile peut différer des autres métazoaires et justifie donc une enquête plus détaillée.

L'arbre phylogénétique a été construit avec des séquences d'acides aminés isolées de leur contexte protéique entier par alignement de séquences multiples. L'histoire évolutive a été déduite à l'aide de la méthode du maximum de vraisemblance sous le modèle LG de substitution d'acides aminés tel qu'implémenté dans MEGA11. L'arbre consensus bootstrap est montré et a été déduit à partir de 1000 répétitions pour représenter l'histoire évolutive des taxons analysés. Les espèces pour lesquelles aucun ARH3 n'a pu être identifié par la recherche BLAST sont surlignées en rouge. Les clades pertinents sont mis en évidence par des branches colorées (Insecta, bleu ; Mammalia, vert ; Nematoda, orange ; Protozoa, marron). Les données de séquence sont fournies dans les données supplémentaires 1.

Pour étudier cette hypothèse, nous avons d'abord confirmé que tous les composants - dParp, dHpf1 et dParg - étaient localisés dans le noyau des cellules S2R + (Fig. 1A supplémentaire) avant de progresser pour élucider la dynamique de l'ADPr chez la drosophile après des dommages à l'ADN. Nous avons exposé les cellules S2R + aux dommages de l'ADN par le peroxyde d'hydrogène (H2O2) et le méthanesulfonate de méthyle (MMS), puis avons comparé le schéma ADPr avant et après les dommages à l'ADN en utilisant différents anticorps et réactifs anti-ADPr (Fig. 2A). Nous avons observé que l'ADPr est rapidement (< 10 min) induite après une exposition au H2O2 et se désintègre rapidement après le stress (< 120 min; Fig. 2A). En revanche, l'agent alkylant MMS a montré une réponse ADPr moins prononcée comparable aux cellules U2OS dans les mêmes conditions de test (Fig. 2A). Le modèle global de poly-ADPr reflète celui des cellules U2OS humaines avec des bandes proéminentes correspondant aux histones et PARP1. Bien que nous ne puissions pas totalement exclure une origine différente du signal, la similitude apparente du signal S2R+ ADPr avec la cellule humaine U2OS, pour laquelle les histones et hPARP1 ont été signalées comme les deux principales cibles de l'ADPr11,12,15 induite par des dommages à l'ADN, suggère fortement que ce signal ADPr est lié aux histones et à dParp. De plus, ces données ont révélé que la drosophile et les cellules humaines présentent une dynamique ADPr comparable en réponse aux dommages à l'ADN14,15,25. Pour déterminer si dParp et dHpf1 sont activement recrutés sur les sites de lésions de l'ADN, des cellules S2R + ont été transfectées avec GFP-dParp ou GFP-dHpf1 et soumises à une microirradiation laser couplée à une imagerie de cellules vivantes (Fig. 2B). Nous avons observé un recrutement robuste de dParp sur les sites de dommages en quelques secondes de dommages induits par laser, comparable à ce qui a été décrit avec hPARP128,46. De même, nous avons également observé le recrutement rapide de dHpf1 sur les sites de dommages, mais pas dans la même mesure que dParp. Cela imite le profil de recrutement humain où PARP1 dépasse le recrutement HPF128.

Des cellules de Drosophila S2R+ et U2OS humaines ont été traitées avec du H2O2 2 mM ou du MMS 5 mM et analysées aux moments indiqués. Les cellules ont été lysées et les protéines ont été séparées par SDS-PAGE puis analysées pour les niveaux de poly-ADPr par immunoblot. La coloration à l'actine et au Ponceau S a été utilisée comme contrôle de chargement. Les étiquettes « PARP » et « histones » à côté de l'image indiquent les tailles approximatives où ces protéines peuvent être trouvées. L'expérience a été répétée indépendamment trois fois avec des résultats similaires. B Images représentatives (en haut) et cinétique (en bas) du recrutement d'EGFP-dParp et d'EGFP-dHpf1 sur des sites de dommages à l'ADN induits par une irradiation laser à 405 nm, dans des cellules Drosophila S2R+. Barre d'échelle, 2 µm. Les données de B sont représentatives de 3 répliques indépendantes (6 à 10 cellules par réplique par condition) avec n = 24 cellules pour EGFP-dParp et n = 22 cellules pour EGFP-dHpf1 et représentent des valeurs moyennes normalisées ± SEM. Les sites d'irradiation sont indiqués par des flèches jaunes. Les cellules C S2R + ont été prétraitées avec du DMSO ou du PARGi 2 μM (PDD00017273) pendant 16 h, suivi d'un traitement avec du H2O2 2 mM pendant le temps indiqué en l'absence ou en présence de PARGi. Les niveaux de poly-ADPr (panneau de gauche) et de pan-ADPr (panneau de droite) ont été analysés par immunoblot. Les étiquettes « PARP » et « histones » à côté de l'image indiquent les tailles approximatives où ces protéines peuvent être trouvées. L'expérience a été répétée indépendamment trois fois avec des résultats similaires.

L'activité canonique PAR hydrolase de dParg a été démontrée32,41,47,48. Pour confirmer que dParg régule les niveaux de PARylation cellulaire lors de dommages à l'ADN, nous avons traité des cellules S2R+ avec l'inhibiteur de PARG PDD00017273 (PARGi)49. Par rapport aux cellules témoins traitées avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) comme témoin négatif, les cellules S2R + traitées au PARGi présentaient des niveaux plus élevés de protéines PARylées à l'état non stimulé (Fig. 2C). Nous avons également confirmé que la PARylation était induite dans les cellules S2R + traitées par PARGi suite à des dommages à l'ADN (Fig. 2C). En revanche, nous n'avons détecté que des différences négligeables dans la pan-ADPr (combinaison de MAR et de PARylation) entre les cellules S2R + traitées au DMSO et au PARGi dans des conditions non stimulées (Fig. 2C). Cependant, nous avons observé que l'ADPr était considérablement stimulée dans les cellules S2R + traitées au PARGi lors de dommages à l'ADN par rapport aux cellules S2R + traitées au DMSO (Fig. 2C). Ces données suggèrent que le PARGi développé contre le PARG humain (hPARG) inhibe efficacement l'activité dParg, bloquant ainsi la dégradation de l'ADPr chez la drosophile et permettant l'enrichissement des sites ADPr.

Ensuite, nous avons cherché à identifier les protéines spécifiques qui sont ADP-ribosylées dans les cellules de Drosophila S2R+ par analyse par spectrométrie de masse. À cette fin, nous avons utilisé l'approche d'enrichissement Af1521 bien établie et analysé des extraits protéiques de cellules S2R + traitées au DMSO et au PARGi en l'absence ou en présence de dommages à l'ADN (Fig. 3A). Dans l'ensemble, nous avons identifié en toute confiance 514 sites ADPr (probabilité de localisation> 0, 9), correspondant à 296 protéines cibles ADPr dans les cellules Drosophila S2R + (Fig. 3B, C et données supplémentaires 2). De manière rassurante, les données ont démontré une bonne probabilité de localisation avec> 75% des correspondances du spectre peptidique ADPr (PSM) possédant une probabilité de localisation> 90% (Fig. 2A supplémentaire). Dans l'ensemble, nous avons observé un degré élevé de reproductibilité entre nos répétitions expérimentales, avec la plus grande variation présente dans les échantillons traités au H2O2 (Fig. 3C, D et Supplémentaire Fig. 2B).

Un aperçu expérimental. Les cultures de cellules S2R + ont été traitées avec du DMSO ou du PARGi 2 μM (PDD00017273) dans des conditions de contrôle ou des conditions de dommages à l'ADN (H2O2) en quatre exemplaires. Les lysats ont été digérés en solution et les peptides modifiés par ADPr ont été enrichis à l'aide d'Af1521 étiqueté GST produit en interne. Les échantillons d'ADPr ont été analysés sur un Thermo Orbitrap Fusion Lumos en utilisant une fragmentation à base d'EThcD. La figure a été en partie générée à l'aide de Servier Medical Art, fourni par Servier, sous licence Creative Commons Attribution 3.0 non transposée. B Histogramme montrant le nombre total de sites et de protéines modifiés par ADPr identifiés et localisés. Diagrammes C de Venn illustrant la distribution de peptides ADP-ribosylés uniques identifiés dans les quatre approches différentes. D Corrélation moyenne de Pearson des sites ADPr identifiés dans les quatre conditions. Les valeurs moyennes de n = 6 ± SD sont représentées. E Aperçu du nombre de sites ADPr identifiés et localisés. n = 4 répétitions de culture cellulaire, les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SEM. (F) Comme (D), montrant l'intensité ADPr. Chaque condition de culture cellulaire a été préparée en quatre exemplaires et les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SEM. Diagramme de Venn à l'échelle G illustrant le chevauchement entre les sites ADPr identifiés dans les conditions DMSO et PARGi, tous deux lors du traitement H2O2. Réseau H STRING visualisant les interactions fonctionnelles entre les protéines avec les sites ADPr spécifiquement trouvés dans les conditions traitées par PARGi. Le score d'interaction minimum requis a été défini sur une confiance élevée (0, 7) et les protéines déconnectées ont été omises du réseau. Les protéines ont été annotées avec des couleurs comme indiqué dans la légende de la figure.

Nous avons identifié le plus grand nombre de sites ADPr dans les échantillons PARGi traités avec H2O2 (483 au total), suivis d'échantillons DMSO traités avec H2O2 (362 au total, Fig. 2C supplémentaire). Dans l'ensemble, les dommages à l'ADN ont entraîné la plus grande différence dans l'ADP-ribosylome (Fig. 2D supplémentaire) et, en moyenne, nous avons remarqué la plus forte augmentation du nombre de sites ADPr lors de la comparaison des cellules traitées au DMSO exposées aux dommages à l'ADN à l'absence de dommages. Cellules traitées au DMSO, avec environ 6 fois plus de sites détectés lors du traitement au H2O2 (Fig. 3E). La même tendance a été observée dans les cellules traitées au PARGi, avec environ 5 fois plus de sites détectés lors du traitement au H2O2. Cette augmentation du nombre de sites ADPr lors de dommages à l'ADN était encore plus importante pour l'intensité des peptides modifiés par ADPr (Fig. 3F). Ici, nous avons observé en moyenne ~ 29 fois et ~ 30 fois plus d'intensité ADPr pour les échantillons DMSO traités au H2O2 et les échantillons PARGi, respectivement. Pour les échantillons induits par des dommages à l'ADN, l'ajout de PARGi a entraîné environ 2 fois plus d'intensité par rapport à la condition DMSO. Lors de l'induction des dommages à l'ADN, le chevauchement entre les cellules traitées au DMSO et les cellules traitées au PARGi était élevé (66%), alors qu'environ 29% des sites étaient spécifiques des échantillons traités au PARGi (Fig. 3G). Cette dernière fraction représente très probablement des sites d'abondance physiologiquement faible ou de renouvellement rapide qui ont été stabilisés par le traitement PARGi. Les sites spécifiques des échantillons traités au PARGi dans des conditions de dommages à l'ADN étaient enrichis en protéines impliquées dans le traitement de l'ARN, l'organisation des chromosomes et le ribosome (Fig. 3H). Cependant, les changements statistiquement significatifs ont été limités à cinq sites régulés positivement lors du traitement PARGi et à un site régulé positivement dans les échantillons traités au DMSO (Fig. 2E supplémentaire).

Comme observé dans les cellules humaines11,12,14,50, pratiquement tous les sites accepteurs d'ADPr identifiés détectés dans cette étude se sont localisés sur les résidus de sérine dans ces conditions expérimentales (Fig. 4A et données supplémentaires 2), démontrant que Ser-ADPr est la principale forme de ADPr dans le Drosophila DDR tel qu'observé chez l'homme. Étant donné que notre enquête précédente sur l'approche d'enrichissement en Af1521 n'a indiqué aucun biais en faveur d'une liaison protéine-ADP-ribose spécifique, nous suggérons que si la modification d'autres résidus d'acides aminés se produit chez la drosophile, leur abondance pourrait être inférieure à la limite de détection. Nous avons constaté que la plupart des résidus de sérine ADP-ribosylés (69, 4%) résidaient dans le motif lysine-sérine (KS) comme on le voit chez l'homme13, 51, suggérant que le consensus de ciblage de Ser-ADPr est conservé au cours de l'évolution (Fig. 4B et données supplémentaires 2 ). De même, les cibles Ser-ADPr sont principalement des protéines nucléaires associées au maintien de la stabilité du génome et de la structure de la chromatine (Fig. 4C).

Un diagramme circulaire visualisant la distribution des résidus d'acides aminés modifiés par ADPr. B Analyse IceLogo montrant le contexte de séquence entourant les sites ADPr de sérine identifiés (étoile bleu clair), les résidus d'acides aminés au-dessus de la ligne étant enrichis. Les fenêtres de séquence de tous les résidus de sérine dans les protéines cibles ADPr ont été utilisées comme référence. Analyse C Gene Ontology visualisant l'enrichissement de toutes les protéines cibles Ser-ADPr par rapport au génome total. CC Compartiment cellulaire ; BP Processus biologique ; Fonction moléculaire MF. D Histogramme montrant l'intensité globale des sites ADPr, l'intensité ADPr des histones et l'intensité ADPr de l'histone H1A Ser199. E Tableau comparant les sites ADPr identifiés chez la drosophile aux sites ADPr identifiés chez l'homme. Analyse d'automodification F dParp, montrant l'abondance relative de modification basée sur l'intensité MS/MS. n = 4 répétitions de culture cellulaire, les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD. G Alignement de séquences multiples de séquences sélectionnées de domaines d'automodification PARP d'insectes et de mammifères. Les sites Ser-ADPr identifiés dans dParp et hPARP1 sont indiqués au-dessus de l'alignement par le symbole à double dague (‡) et koppa (ϟ), respectivement. L'indexation indique la position du résidu dParp. L'alignement étendu des insectes est fourni dans la Fig. 2 supplémentaire et les séquences dans le tableau supplémentaire 1.

Dans les lignées cellulaires humaines, il a été démontré que les histones sont une cible majeure de l'ADPr50,53, et nous confirmons que c'est également le cas chez la drosophile (Fig. 4D). Plus précisément, nous avons constaté que l'histone H1 de Drosophila est l'une des protéines les plus ADP-ribosylées, avec des modifications sur plusieurs sites et Ser199 identifié comme le résidu le plus abondamment modifié (Fig. 4D, Fig. 3A supplémentaire et Données supplémentaires 2). Bien qu'aucun des sites ADPr de l'histone H1 ne soit identique aux sites trouvés sur l'histone H1 humaine, un certain nombre d'autres sites Ser-ADPr de Drosophila dans d'autres protéines sont identiques à ceux de leurs homologues humains. Par exemple, nous avons observé ici l'ADPr sur Ser10 et Ser28 sur l'histone H3 de Drosophila, qui sont également modifiées sur l'histone H3 humaine conformément aux observations précédentes11,12,14,19,50. Alors que S10 ADPr a été observé chez la drosophile dans des conditions physiologiques, ADPr sur Ser28 n'a été observé que lors de dommages à l'ADN. Drosophila DNAlig1 était ADP-ribosylé sur Ser4, qui est également observé dans Lig111,12 humain. Un autre exemple était Drosophila BLM, qui était ADP-ribosylée sur Ser1424, correspondant à Ser1342 humain (Fig. 4E) 12.

En plus de ces cibles trans, dParp était auto-ADP-ribosylé sur quatre résidus sérine (Ser362, Ser491, Ser494 et Ser496) avec l'intensité de ces sites de modification suivant la tendance mondiale pour l'ADPr total en ce qui concerne les traitements PARGi et H2O2 ( Fig. 3B–E supplémentaire et données supplémentaires 2). Cependant, la fraction relative de l'intensité de l'ADPr variait selon les différentes conditions, Ser494 étant le plus abondamment modifié dans des conditions de contrôle et Ser491 en cas de dommages à l'ADN (Fig. 4F). L'automodification observée de dParp était localisée dans une région correspondant au domaine d'automodification décrit précédemment de PARP1 humain (hPARP1; aa 373–527), qui contient les principaux sites accepteurs Ser499, Ser507 et Ser51911,30,50. Parmi les quatre sites d'automodification de dParp, Ser491 et Ser496 sont absolument, Ser494 partiellement (75%, 27 des 36 espèces d'insectes sélectionnées) et Ser362 non conservé chez les insectes (Fig. 4 supplémentaire et données supplémentaires 1). De plus, le contexte de séquence des sites d'automodification PARP1 des mammifères et des insectes est conservé à l'intérieur, mais pas à travers, leurs classes phylogénétiques respectives. Il est frappant de constater que le positionnement des principaux sites d'automodification par rapport aux autres domaines/régions PARP1 est hautement conservé (Fig. 4G). Cela suggère que le rôle potentiel de l'automodification de PARP1 dans la régulation de son recrutement et de sa libération des sites de dommages à l'ADN repose sur un positionnement relatif dans le contexte structurel plutôt que sur le contexte exact des acides aminés. Ceci est en outre étayé par la nature de l'automodification PARP1, qui consiste en des chaînes ADP-ribose allongées et ramifiées qui peuvent empêcher la reconnaissance du contexte de la séquence.

Alors que la plupart des cibles protéiques Ser-ADPr identifiées étaient partagées entre l'homme et la drosophile, nous avons également identifié 25 cibles Ser-ADPr spécifiques à la drosophile (dont onze protéines de fonction inconnue). L'analyse de l'ontologie des gènes montre un fort enrichissement des composants cellulaires associés aux chromosomes tels que la région hétérochromatique et le chromosome polytène (Fig. 4C). Par exemple, ADPr sur Ser21 de D1, une protéine chromosomique multi-crochets AT, présentait la deuxième intensité la plus élevée en protéines totales tandis que Drosophila HP5, identifiée comme un interacteur HP1, contenait six sites de modification Ser-ADPr (Ser98, Ser101, Ser211, Ser249, Ser347 et Ser399).

Fait intéressant, le traitement PARGi a doublé l'abondance des sites Ser-ADPr, indiquant que dParg pourrait être responsable de l'élimination du mono-Ser-ADPr chez la drosophile (Fig. 4E). Pour confirmer cela, nous avons d'abord établi que dParg recrute sur les sites de dommages à l'ADN induits par laser (Fig. 1B supplémentaire). Nous avons ensuite étudié le profil ADPr des cellules S2R + soumises à un knockdown du gène dParg ou du gène LacZ (utilisé comme contrôle) par l'ARN double brin (ARNdb) avant et après exposition à H2O2 (Fig. 5). Deux ARNdb différents, correspondant à différentes parties des séquences d'ADN codantes des gènes dParg (Fig. 5A), ont été utilisés pour confirmer que les effets étaient spécifiques à la déplétion de dParg (Fig. 5B). Ensuite, nous avons analysé les produits de l'ADPr médiée par PARP avant et après le traitement par H2O2 par immunotransfert d'extraits de cellules entières. Fait intéressant, les niveaux de protéine mono-ADPr dans les deux lignées cellulaires knockdown dParg avant et après les dommages à l'ADN ont augmenté (Fig. 5C – E), tandis que les niveaux de polymère n'ont augmenté qu'après l'exposition au H2O2 (Fig. 5E, F). Cela suggère que dParg peut cliver les liaisons terminales in vivo et, avec nos données ADP-ribosylomiques, indique que les résidus de sérine sont des cibles pour l'ADPr induite par des dommages réversibles à l'ADN.

Une structure schématique de la région génomique du gène dParg. Les cases blanches et les cases grises montrent la région non traduite et la région codante du gène dParg, respectivement. Les surlignages noirs montrent les régions ciblées par les ARNdb PARG. B L'analyse relative de l'expression génique du gène dParg dans les cellules S2R+ telle que déterminée par RT-qPCR et normalisée en utilisant le gène RpL39 comme contrôle interne. Les barres d'erreur indiquent le SD moyen de trois répliques indépendantes. Les astérisques indiquent une signification statistique par rapport au contrôle, telle que déterminée par le test t (****p < 0,0001, valeur P bilatérale, PARG-1 vs LacZ, p = 6,9 × 10−8, PARG-2 vs LacZ , p = 6,3 × 10−8). Les cellules de Drosophila S2R+ ont été traitées avec du H2O2 2 mM analysé aux moments indiqués. Les protéines C–F des lysats de cellules entières ont été séparées par SDS-PAGE puis analysées par immunotransfert à l'aide de mono-ADPr- (anticorps MAR AbD33204. C mono-ADPr- (réactif de détection MAR MABE1076. D pan-ADPr- (PAR et Réactif de détection MAR, MABE1016. (E) et poly-ADPr- (anticorps 4336-BPC-100. Réactif de liaison F. La coloration Ponceau S et l'actine ont été utilisés comme contrôle de chargement. Les étiquettes « PARP » et « histones » à côté du L'image indique les tailles approximatives où ces protéines peuvent être trouvées Ces expériences ont été répétées indépendamment trois fois avec des résultats similaires.

Ensuite, nous avons décidé de reconstituer Ser-ADPr in vitro en utilisant des protéines de Drosophila. Tout d'abord, nous avons démontré que le complexe recombinant dParp1: dHpf1 peut efficacement ADP-ribosyler la queue de l'histone H3 in vitro, comme indiqué précédemment pour le recombinant hPARP1: hHPF1 (Fig. 6A) 11,15,18. Pour confirmer la nature de la modification, nous avons purifié le peptide modifié et l'avons incubé avec deux (ADP-ribosyl)hydrolases humaines, hTARG1 et hARH3, qui sont respectivement spécifiques de l'ADPr lié à Glu/Asp et Ser21,25,54. Ici, nous avons pu montrer que hARH3 éliminait efficacement l'ADPr du peptide histone H3, contrairement à hTARG1, suggérant ainsi fortement que la modification est bien Ser-ADPr (figure 6B).

Un peptide d'histone Mono-Ser-ADPr de H3 (aa 1–21) a été obtenu par incubation avec un complexe recombinant hPARP1: hHPF1 ou un complexe recombinant dPARP1: dHPF1 en utilisant 32P-NAD + comme donneur d'ADP-ribose. Les réactions PARP ont été stoppées par l'ajout d'olaparib. L'expérience a été répétée indépendamment trois fois avec des résultats similaires. B Les peptides d'histone H3 ADP-ribosylée de (A) ont été purifiés à partir de la réaction et traités avec hARH3 recombinant pour confirmer la présence de Ser-ADPr. L'expérience a été répétée indépendamment trois fois avec des résultats similaires.

Comme mentionné précédemment, les espèces de Drosophila manquent d'orthologues ARH3 et, par conséquent, le clivage de la liaison (ADP-ribosyl)-seryl doit être effectué par une autre enzyme. La persistance du signal ADP-ribosylation dans nos expériences utilisant PARGi dans des cellules S2R + suggère que dParg est impliqué dans le renouvellement du signal ADPr dépendant des dommages à l'ADN (Figs. 2B, C, 3 et 4). Outre dParg, Drosophila exprime trois homologues de hTARG1 (CG33054/dTarg1, CG33056/dTarg2 et CG34261/dTarg355) dont la contribution potentielle à l'élimination de Ser-ADPr ne peut être exclue. Pour évaluer la spécificité du substrat de ces enzymes, nous avons effectué des dosages de (ADP-ribosyl) hydrolase en utilisant différents substrats modèles en utilisant les hydrolases humaines caractérisées hPARG, hARH3 et hTARG1 comme témoins (Fig. 7 et Fig. 5 supplémentaire). Plus précisément, nous avons utilisé la capacité précédemment établie de hPARP1 WT à générer du poly-ADPr lié à la sérine15,18 et au glutamate5,56 en présence et en l'absence de hHPF1, respectivement30. De même, nous avons généré les variants mono-ADPr en utilisant le mutant hPARP1 E988Q, qui est une mono-(ADP-ribosyl)transférase57 spécifique. hPARG et dParg ont facilement éliminé les polymères ADP-ribose, alors que le renouvellement par hARH3 est moins prononcé (Fig. 6A et Fig. 5A supplémentaire), mais étaient incapables d'éliminer efficacement la liaison glutamate-ADPr terminale (Fig. 5A, B supplémentaire) . De plus, alors que dParg et hARH3 ont montré la capacité d'éliminer la mono-Ser-ADPr des peptides et la hPARP automodifiée, cela n'a pas été observé pour hPARG et les orthologues de Drosophila TARG (Fig. 7).

A Élimination de poly-Ser-ADPr sur hPARP1 automodifiée en présence de hHPF1 et de tétramère d'histone H3/H4 poly-Ser-ADP-ribosylée par des hydrolases humaines et de drosophile (ADP-ribosyl). La réaction a été réalisée comme sur la figure 5A, sauf que le tétramère d'histone H3/H4 a été utilisé à la place du peptide d'histone H3. Le panneau inférieur montre le SDS-PAGE coloré au CBB des protéines. L'expérience a été répétée indépendamment trois fois avec des résultats similaires. B Élimination de poly-ADPr sur hPARP1 automodifié (0,5 μM), en présence de hHPF1 (0,5 μM) et de peptide H3 mono-Ser-ADP-ribosylé (aa 1–21, 0,5 μg) par l'homme et la drosophile (ADP-ribosyl )hydrolases. Les réactions ont été effectuées comme décrit sur la figure 5A. Le panneau inférieur montre le SDS-PAGE coloré au CBB des protéines. L'expérience a été répétée indépendamment trois fois avec des résultats similaires. C Élimination du mono-Ser-ADPr sur le peptide histone H3 mono-Ser-ADP-ribosylé (aa 1–21) par les hydrolases humaines et de drosophile (ADP-ribosyl). Les réactions ont été réalisées comme décrit sur la figure 1A et le peptide purifié comme décrit sur la figure 1B. Le panneau inférieur montre le SDS-PAGE coloré au CBB des protéines. L'expérience a été répétée indépendamment trois fois avec des résultats similaires. D Mesures de l'activité hydrolase des hydrolases indiquées contre l'histone synthétique H2B peptide mono-Ser-ADPr sur S7 en utilisant le test AMP-Glo ​​(Promega). Les échantillons sont corrigés en arrière-plan et normalisés à hARH3. Les données représentent des mesures en triple de trois expériences indépendantes ± SEM.

Lors de l'utilisation du tétramère d'histone H3.1/H4 sérine-PARylée comme substrat13, nous avons observé hPARP1 poly-Ser- et mono-Ser-ADP-ribosylée, ce qui nous a permis d'évaluer séparément l'activité de toutes les (ADP-ribosyl)hydrolases testées contre poly-Ser- et mono-Ser-ADPr (Fig. 7A). Le test montre clairement que dParg inverse efficacement l'ADPr des hPARP1 poly-Ser et mono-Ser-ADP-ribosylées et des histones. Inversement, hPARG n'éliminait que PAR de hPARP1 et des histones, tandis que hARH3 éliminait efficacement mono-Ser-ADPr de hPARP1 mais agissait mal sur PAR et ne montrait aucune activité contre les histones modifiées. Pour comparer la capacité de hARH3 et dParg à éliminer le mono-Ser-ADPr, nous avons effectué une réaction d'hydrolases en utilisant un peptide d'histone H2B synthétique, suivie d'une conversion de l'ADP-ribose libéré en AMP par NudT5 humain et d'une détection de luminescence à l'aide de l'AMP- commercial. Dosage Glo (Promega ; Fig. 7D)58,59,60. Mono-Ser-ADPr hydrolysé à la fois par hARH3 et dParg, bien que hARH3 agisse plus efficacement. Ensemble, nos données montrent que l'inversion complète de Ser-ADPr chez la drosophile ne repose que sur une seule enzyme (dParg), contrairement au système humain, qui nécessite deux enzymes (hPARG et hARH3). De plus, la différence d'activité d'hydrolyse mono-Ser-ADPr de hARH3 et dParg suggère que le maintien des deux fonctions catalytiques - hydrolyse mono-Ser-ADPr et PAR - au sein d'une seule protéine (PARG) peut avoir un coût d'efficacité.

Pour étudier la capacité inattendue de dParg à éliminer les chaînes PAR ainsi que le mono-Ser-ADPr, nous avons comparé son architecture de domaine à hPARG (Fig. 8A). Alors que les deux enzymes partagent un motif de macrodomaines accessoire et catalytique conservé, qui dans hPARG est responsable de la dégradation de PAR, dParg n'a pas la région N-terminale de hPARG et possède un domaine C-terminal supplémentaire (Fig. 8A). Par conséquent, nous avons recherché si ce domaine pouvait être responsable de l'hydrolyse de la liaison sérine-ribose. Pour tester cette hypothèse, nous avons généré trois troncatures du domaine dParg C-terminal et évalué la capacité de ces variants à éliminer l'auto-PARylation hPARP1 (Fig. 8B) et l'histone H3 mono-Ser-ADPr (Fig. 8C). Les trois troncatures ont montré que dParg Δ554–723 perdait son activité contre PAR et mono-Ser-ADPr, probablement en raison de la contribution du domaine C-terminal à l'intégrité structurelle de l'enzyme, alors que dParg Δ558–723 et dParg Δ574–723 conservaient la capacité d'éliminer à la fois le PAR et le mono-Ser-ADPr. Ces résultats montrent que l'extension C-terminale de dParg n'est pas responsable de son activité spécifique de Ser-ADPr et suggèrent que le site actif conservé doit être responsable à la fois de l'activité d'élimination de PAR et de Ser-ADPr.

Une représentation schématique de l'architecture du domaine PARG. Le domaine catalytique est composé de deux sous-domaines ; un domaine accessoire (AD, jaune) et un macrodomaine (macro, rouge). Les limites de domaine sont données ci-dessous et le motif catalytique EE (ligne noire) au-dessus du diagramme. Abréviation C. elegans PARG1, cPARG1; D. melanogaster Parg, dParg; Homo sapiens PARG, hPARG; Tetrahymena thermophila Parg, tParg. B Activité des mutants catalytiques dParg et troncatures C-terminales sur hPARP1 poly-Glu-automodifié. hPARP1 poly-Glu-automodifiée a été obtenue comme décrit sur la figure 6C et ensuite complétée avec dParg WT ou avec les mutants indiqués. L'expérience a été répétée indépendamment trois fois avec des résultats similaires. C Activité des mutants catalytiques dParg et des troncatures C-terminales sur le peptide histone H3 mono-Ser-ADP-ribosylé purifié (aa 1–21). Le peptide d'histone H3 mono-Ser-ADP-ribosylé (aa 1–21) a été obtenu comme décrit dans Méthodes et ensuite complété avec dParg WT ou avec les mutants indiqués. L'expérience a été répétée indépendamment trois fois avec des résultats similaires.

La caractérisation préalable des PARG a identifié une boucle catalytique contenant deux résidus absolument conservés (Glu755 et Glu756 chez l'homme) qui sont essentiels à l'élimination des chaînes PAR (Fig. 8A, B et Supplémentaire Fig. 6)24. Nous avons muté les résidus dParg correspondants (Glu340 et Glu341) en aspartate et en alanine pour déterminer si ces mutants conserveraient leur capacité à éliminer le mono-Ser-ADPr. Tout d'abord, nous avons évalué à la fois WT et dParg mutant par rapport à hPARP1 automodifié (Fig. 8B). Comme prévu, ces mutations ont aboli l'activité de dParg contre PAR. De même, nous n'avons pu détecter aucune activité dParg contre l'histone H3 mono-Ser-ADP-ribosylée (Fig. 8C). Ces données montrent clairement que ces mutations abolissent l'activité de dParg, soutenant l'idée que le même site actif est responsable à la fois de l'élimination du PAR et du mono-Ser-ADPr et laissant la question de savoir comment dParg élimine le mono-Ser-ADPr.

La découverte que le domaine catalytique dParg a développé une activité d'élimination de Ser-ADPr nous a incités à examiner si les homologues de PARG d'autres organismes pouvaient avoir une telle activité. Nous avons testé l'activité des homologues de PARG du cilié Tetrahymena thermophila (tParg). En l'absence de HPF1, les variants WT de tous les PARG testés sont capables d'éliminer le PAR lié au glutamate de la hPARP1 automodifiée, mais laissent une seule bande correspondant au mono-Glu-ADPr hPARP1 (Fig. 9A). L'activité a été abrogée dans le mutant catalytique tParg E256Q. Fait intéressant, tParg se comporte de manière similaire à dParg en ce qui concerne l'élimination du mono-Ser-ADPr du peptide H3 modifié, et cette activité a été perdue dans le mutant tParg E256Q mort catalytiquement (Fig. 9B). Ces tests ont confirmé que l'élimination du mono-Ser-ADPr par les enzymes PARG n'est pas unique à la drosophile, mais plutôt un mécanisme partagé par au moins un autre phylum dépourvu d'ARH3 (Fig. 1A).

A Activité de l'homologue PARG de T. thermophila contre hPARP1 automodifié par poly-Glu. La hPARP1 poly-Glu-automodifiée a été obtenue comme décrit sur la figure 6C. L'expérience a été répétée indépendamment trois fois avec des résultats similaires. B Activité de tParg sur le peptide histone H3 mono-Ser-ADP-ribosylé purifié (aa 1–21). Le peptide histone H3 mono-Ser-ADP-ribosylé (aa 1–21) a été obtenu comme décrit dans les méthodes. L'expérience a été répétée indépendamment trois fois avec des résultats similaires.

Pour mieux comprendre la capacité de dParg à éliminer Ser-ADPr, nous avons résolu deux structures de la troncature catalytiquement active dParg Δ574–723 : la structure apo a été résolue à une résolution de 2,47 Å (PBD 8ADK, Fig. 10A et données supplémentaires 2 ) et la structure co-cristalline avec PARGi à une résolution de 2, 51 Å (PDB 8ADJ, Fig. 7 supplémentaire et données supplémentaires 2). Les deux structures sont très similaires avec les résidus 26 à 525 et 533–547 clairement visibles dans la densité électronique et une RMSD de 0,139 Å sur 369 Cα alignés. La structure dParg est composée d'un pli de macrodomaine central qui abrite la fente de liaison au substrat prédite ainsi que les résidus catalytiques61,62. Le macrodomaine est prolongé par un domaine accessoire hautement structuré et conservé de sorte que le domaine global est composé d'une feuille β torsadée, mixte, à dix brins flanquée de deux sous-domaines à prédominance α-hélicoïdale (Fig. 8A). La structure globale de dParg est similaire à celle des autres PARG avec des RMSD de 0,586 Å sur 381 Cα alignés pour l'homme (PDB 4B1G), 0,651 Å sur 366 Cα alignés pour la souris (mPARG; PDB 4FC2) et 1,816 Å sur 255 Cα alignés pour tParg (APB 4EPP, figure 10B). De même, le complexe dParg:PARGi ressemble étroitement aux complexes hPARG avec des inhibiteurs similaires (RMSD de 0,514 Å sur 374 alignés Cα pour le PDD00017262 [PBD 5LHB] et 0,491 Å sur 369 alignés Cα pour le complexe PDD00017299 [PDB 6HML]). La liaison PARGi chevauche la région de coordination de l'adénosine dans la fente de liaison au substrat. La liaison est étroitement coordonnée avec des interactions d'empilement π échelonnées entre Tyr380 / Phe485 et le fragment 2,4-quinazolinedione (Fig. 7 supplémentaire) ainsi que des interactions polaires avec la chaîne principale de Ile311, Phe485 (Fig. 7 supplémentaire) et le chaînes latérales de Glu312, Gln339 et Phe485 (Fig. 7 supplémentaire). Il est intéressant de noter que dans le complexe hPARG:ADPr (PDB 4NA0), Phe902, qui est isostructural à dParg Phe485, s'empile avec le cycle adénine, ce qui nécessite une rotation de la chaîne latérale d'environ 90° par rapport à l'interaction d'empilement de l'inhibiteur. Cela montre que la liaison de l'inhibiteur non seulement entre en compétition pour l'espace de liaison, mais modifie également les contacts cruciaux avec le substrat.

Une représentation de la surface du ruban d'apo dParg. Le dimère ADP-ribose (jaune) de la structure complexe hPARG: ADP-ribose dimère aligné est donné pour mettre en évidence le site actif. Les caractéristiques structurelles importantes pour la catalyse sont mises en évidence : boucles de domaine accessoire 1 et 2, boucle AD 1 et 2 ; boucle catalytique, boucle 1 ; boucle de liaison diphosphate, boucle 2; fermoir tyrosine, boucle Tyr. B Représentation en ruban de l'alignement structurel des domaines PARG des espèces indiquées (drosophile, rouge ; humain, jaune ; souris, orange ; T. thermophile, blanc). Les résidus catalytiques (Glu340/Glu341 dans dParg) sont surlignés en noir. C Représentation ruban-réglisse de l'interaction boucle 1-AD-boucle 1 des PARG Drosophile, humain et T. thermophile. Les interactions polaires sont mises en évidence sous forme de lignes pointillées noires et les molécules d'eau impliquées dans l'interaction sous forme de sphères rouges.

La comparaison du dParg avec le hPARG et le mPARG de mammifère ainsi que les structures de tParg du protozoaire montre une architecture de site actif presque identique (Fig. 9B). La position de la boucle catalytique (boucle 1) est isostructurale dans les structures comparées, tandis que la boucle de liaison au diphosphate (boucle 2) est connue pour subir un réarrangement conformationnel lors de la liaison au substrat (Fig. 10B et Fig. 7 et 8 supplémentaires et Tableau supplémentaire 1)63,64. La boucle 2 semble se cristalliser en position ouverte et ressemble étroitement à la structure de l'apo mPARG (Fig. 8 supplémentaire). Dans la structure complexe mPARG: ADPr (PDB 4NA0), la boucle se déplace légèrement dans la fente de liaison du substrat permettant aux atomes d'azote de la chaîne principale de Gly866 et Ala867 d'interagir avec les atomes d'oxygène phosphate de l'ADP-ribose. La liaison au substrat s'accompagne en outre du repositionnement de Phe868 (Phe458 dans dParg) et His821 (His413 dans dPARG), qui sont déplacés de la fente de liaison et contribuent à la coordination du ribose distal (Fig. 7 supplémentaire). Ces résultats suggèrent qu'il n'y a pas de différences structurelles majeures dans la coordination de la fraction ADP-ribose ou le placement des résidus catalytiques et suggèrent des différences subtiles entre les PARG qui peuvent supprimer la liaison terminale Ser-ADPr et ceux qui ne le peuvent pas.

Enfin, nous avons étudié les caractéristiques structurelles adjacentes à la boucle 1 : deux boucles situées dans le domaine accessoire ont été identifiées qui prennent en charge le positionnement de la boucle 1 ainsi que l'interaction accessoire-macrodomaine (appelée boucle AD 1 et 2 ; Fig. 10A, B et Fig. . 6). L'interaction boucle 1: AD-boucle 1 est stabilisée par un réseau d'eau étendu dans hPARG (Fig. 10C). Cependant, ces interactions sont considérablement réduites dans dParg, tandis que la boucle AD 1 est absente dans tParg (Fig. 10C). La principale différence dans le réseau de coordination entre loop1 et AD-loop 1 est la présence d'un résidu thréonine (Thr748 dans hPARG, alors que dParg et tParg contiennent un résidu leucine (Leu333 et Leu248, respectivement) en position isostructurale. Notre analyse phylogénétique ont montré que la thréonine est conservée dans les mammifères et que la leucine peut être trouvée dans les diptères, les nématodes et les protozoaires (Fig. 6 supplémentaire), suggérant ainsi qu'il s'agit bien d'un facteur dans la spécificité du substrat.Cependant, la distance du motif catalytique EE comme ainsi que son orientation à l'opposé du substrat (Fig. 10A) ne suggère aucune implication directe dans le mécanisme catalytique.

L'ADP-ribosylation liée à la sérine est un mécanisme de signalisation crucial dans le DDR des humains et d'autres espèces de mammifères. Ici, nous avons fourni la preuve que cette variante de signalisation est répandue dans tout l'Animalia et peut être une caractéristique déterminante de la régulation DDR de ce royaume. À l'aide de la spectrométrie de masse de pointe, nous fournissons une première ébauche de l'ADP-ribosylome de Drosophila identifiant > 500 sites ADPr hautement fiables. Auparavant, il a été rapporté que l'ADPr modifiait les résidus d'acide aspartique, d'acide glutamique, de lysine et d'arginine52,65,66. La découverte relativement récente de résidus de sérine en tant que sites accepteurs13, a conduit à l'identification de la sérine comme le résidu d'acide aminé modifié le plus abondamment en cas de dommages à l'ADN dans la culture cellulaire12,14. En combinant la stratégie d'enrichissement Af1521, qui est capable d'identifier l'ADPr sur tous les résidus d'acides aminés possibles50,67,68, avec la fragmentation ETD pour une localisation correcte du site de modification12, nous avons identifié la sérine comme le résidu modifié le plus abondamment chez la drosophile dans ces conditions expérimentales . Pourtant, les conditions expérimentales ainsi que la profondeur du séquençage pourraient entraîner l'absence d'autres résidus accepteurs d'acides aminés connus. Notre analyse du cycle Ser-ADPr chez D. melanogaster a en outre révélé une conservation frappante avec la voie de signalisation humaine. Au niveau moléculaire, non seulement le motif consensus de l'ADPr de mammifère « KS » est conservé, mais nous observons un large chevauchement avec les cibles ADPr précédemment identifiées chez l'homme. Ceci est particulièrement vrai pour les principaux accepteurs de l'ADP-ribose tels que PARP1 et les histones. Chez les deux espèces, les voies pertinentes pour la stabilité du génome, la régulation de la structure de la chromatine et la transcription sont des cibles majeures pour cette modification. Ainsi, nos données suggèrent que la drosophile peut servir d'organisme modèle pour fournir des informations sur la fonction physiologique de la signalisation Ser-ADPr. Cela inclut la possibilité de comprendre les liens entre cette modification et les maladies associées, notamment la neurodégénérescence et le cancer30,41,69,70,71. À cet égard, il a été précédemment montré que le déficit en dParg pouvait être complété à l'aide du gène ARH3 humain71. De plus, comme la région d'automodification de hPARP1 qui s'est avérée importante pour le piégeage de hPARP1 lors de ruptures d'ADN et que la réponse de l'inhibiteur de PARP chez l'homme est conservée de manière fonctionnelle chez les espèces de drosophile (Fig. 4G et Fig. 4 supplémentaires), ce modèle pourrait être utile pour comprendre les effets physiologiques des inhibiteurs de PARP cliniquement pertinents30.

Notre analyse phylogénétique met en évidence que parmi les espèces porteuses de HPF1, ARH3 est absent chez les protozoaires, les nématodes, les lépidoptères et les diptères. En revanche, ARH3 peut être identifié dans la plupart des animaux, y compris ceux basaux des phylums Placozoa, Porifera ou Cnidaria. Ce schéma de présence et d'absence d'ARH3 suggère fortement une histoire évolutive qui (i) contient un gain d'ARH3 au début de l'évolution d'Animalia et (ii) au moins deux événements de perte indépendants : le premier dans la scission entre les nématodes et les arthropodes, et le second lors de la diversification au sein du super-ordre Endopterygota. Fait intéressant, PARP2, qui chez l'homme peut également générer Ser-ADPr, est également absent chez la drosophile. Par conséquent, il semble que la drosophile, malgré la conservation de la fonction physiologique, n'utilise qu'un système Ser-ADPr minimal pour la régulation du DDR consistant en dHPf1, dParp comme seul PARP de réparation de l'ADN (bien qu'avec une architecture de domaine hPARP1), ainsi que dParg, qui combine à la fois l'activité poly- et mono-Ser-(ADP-ribosyl)hydrolase. Compte tenu des similitudes fonctionnelles, cela peut être avantageux pour certaines études car cela permet une manipulation plus facile de l'établissement et de la suppression du signal. De plus, notre étude a révélé que les outils développés pour l'étude et l'application clinique de la Ser-ADPr humaine, tels que les réactifs de détection de l'ADPr et les anticorps ainsi que les inhibiteurs, peuvent être appliqués à l'étude de la signalisation de l'ADPr chez la drosophile. Nos données structurelles ont révélé que le site actif de dParg est conservé par rapport aux PARG de mammifères et de protozoaires, indiquant ainsi que la différence d'activité n'est pas le résultat d'un mécanisme catalytique altéré. Ensemble, nos données suggèrent que la capacité à cliver la liaison Ser-ADPr repose sur des différences structurelles subtiles entourant le site actif qui peuvent (dés) permettre l'accès de certains substrats. Cette idée est en outre étayée par les différences de géométrie du substrat. Les données structurelles d'un dimère ADP-ribose en complexe avec hPARG (PDB 5A7R) indiquent que l'unité n-1 s'étend linéairement hors du site actif (Fig. 10A). En revanche, le peptide modifié par la sérine co-cristallisé avec hARH3 (PDB 7AKS) est perpendiculaire à la poche de liaison ADP-ribose. Cependant, d'autres études sont nécessaires pour discerner le mode d'interaction des différents PARG avec leurs différents substrats. Sur la base de nos découvertes phylogénétiques et biochimiques, il est intéressant de supposer que la capacité des PARG à cliver la liaison protéine-ribose terminale peut ne pas être limitée aux mouches des fruits. Ceci est soutenu par (i) l'identification de plusieurs branches évolutives qui portent HPF1, mais manquent d'ARH3 (Fig. 1), (ii) notre confirmation expérimentale que tParg peut également supprimer Ser-ADPr (Fig. 9) ainsi que (iii ) observations récentes sur des plantes montrant qu'Arabidopsis thaliana Parg1 peut éliminer le mono-ADPr de SZF172. Notamment, des duplications du gène PARG ont été décrites à la fois chez les plantes et chez C. elegans73,74, ce qui indique une diversification des systèmes de signalisation ADPr connus qui pourrait réserver de nouvelles surprises pour les découvertes futures.

La lignée cellulaire Drosophila S2R+ a été achetée au DGRC (https://dgrc.bio.indiana.edu/Home) et a été cultivée dans le milieu de Drosophila Schneider (21720-024, Gibco) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (10 500 -056, Gibco) et pénicilline-streptomycine à 1 % (100 U/ml, 15140-122, Gibco) à 25 °C et passages tous les 3 à 4 jours. La lignée cellulaire d'ostéosarcome humain U2OS a été achetée à l'ATCC (HTB-96) et a été cultivée dans du DMEM (10566016, Gibco) additionné de 10 % de FBS (F9665, Sigma) et de pénicilline-streptomycine (100 U/mL, GIBCO) à 37 ° C avec 5 % de CO2 et passages tous les 3 à 4 jours. Pour toutes les expériences d'induction de dommages à l'ADN, les cellules ont été ensemencées à une densité de 5 × 106 cellules pour les cellules S2R + ou de 2 × 106 cellules pour les cellules U2OS dans une boîte de 6 cm. Le lendemain, les cellules ont été soigneusement lavées avec du PBS et endommagées avec du H2O2 2 mM (H1009, Sigma) ou du MMS 5 mM (129925, Sigma) dans du PBS plus du calcium et du magnésium (DPBS, Gibco, 14040-133) pendant les temps indiqués. Pour le traitement de l'inhibiteur de PARG, 5 × 106 cellules ont été ensemencées dans une boîte de 6 cm. Le lendemain, les cellules ont été traitées avec un inhibiteur de PARG 2 μM (PDD00017273, Sigma) pendant 16 h, tandis que les cellules témoins ont été traitées avec du DMSO. Cela a été suivi d'un traitement au H202 comme décrit ci-dessus.

Les cellules ont été lysées dans du TrisHCl 50 mM (pH 8,0), du NaCl 100 mM et du Triton X-100 à 1 % (v/v), du MgCl2 5 mM, du DTT 1 mM, additionné de 1 × inhibiteur de protéase (Roche), 1 μM PARG inhibiteur (PDD00017273, Sigma) et inhibiteur de PARP 1 μM (Olaparib, LKT LABS). Les lysats ont été incubés avec 0,1% de benzonase (Sigma) pendant 30 min à 4°C. La fraction soluble a été mélangée avec du tampon d'échantillon NuPAGE LDS (Invitrogen) avec 50 mM de DTT et les protéines ont été dénaturées à 95 ° C pendant 5 min. Les extraits cellulaires entiers des cellules S2R + ont été séparés par électrophorèse sur des gels NuPAGE Novex 4–12% Bis-Tris (Invitrogen) et transférés sur des membranes de nitrocellulose (Bio-Rad) pendant 30 min à l'aide du système de transfert Trans-Blot Turbo (Bio-Rad). Les membranes buvardées ont été bloquées avec du tampon PBS contenant 0,1 % (v/v) de Tween 20 et 5 % (p/v) de poudre de lait écrémé pendant 1 h à température ambiante, puis incubées avec un anticorps de lapin anti-poly ADPr (4336-BPC- 100, Trevigen, 1:1 000, RRID : AB_2721257), lapin anti-poly ADPr anti réactif (MABE1031, Millipore, 1:500, RRID : AB_2665467), lapin anti-pan ADPr anti réactif (MABE1016, Millipore, 1:1 000, RRID : AB_2665466), lapin anti-mono ADPr anti réactif (MABE1076, Millipore, 1:500, RRID : AB_2665469), lapin anti-mono ADPr anticorps (AbD33204, BioRad, 1:1 000), lapin anti-phosphore Histone H2AvD (Ser137 ) anticorps (600-401-914, Rockland, 1:3 000, RRID : AB_828383), anticorps de souris anti-phosphor Histone H2A.X (Ser139) (clone JBW301, 05-636, Millipore, 1:500, RRID : AB_309864) ou des anticorps monoclonaux anti-actine de souris (JLA20, concentration, Developmental Studies Hybridoma Bank, 1:10 000, RRID : AB_528068) à 4 °C pendant la nuit. Après lavage avec du PBS contenant 0,1% (v/v) de Tween 20, les blots ont été incubés avec une IgG anti-lapin marquée à la peroxydase de raifort (P0399, Dako, 1:4 000, RRID : AB_2617141) ou anti-IgG de souris (P0447, Dako, 1:4 000, RRID : AB_2617137) pendant 1 h. La détection a été réalisée à l'aide d'un substrat de transfert Western Pierce ECL (Thermo Scientific) et analysée par luminographie à l'aide d'Hyperfilm ECL (Amersham). Les expériences ont été menées pour un minimum de trois répétitions indépendantes.

Les peptides ADP-ribosylés ont été lysés et enrichis comme décrit précédemment réf. 12, 51, 75. En bref, les culots cellulaires ont été lysés dans 10 volumes de culots de tampon de lyse (chlorhydrate de guanidine 6 M, TrisHCl 50 mM [pH 8,5]) et une lyse complète a été obtenue en alternant une agitation vigoureuse avec un vortex vigoureux. Lors de la réduction et de l'alkylation à l'aide de TCEP et de CAA, les protéines ont été digérées à l'aide de Lysyl Endopeptidase (Lys-C, 1:100 w/w; Wako Chemicals) pendant 3 h et diluées avec trois volumes de bicarbonate d'ammonium 50 mM. Les échantillons ont ensuite été digérés pendant la nuit en utilisant de la trypsine de qualité de séquençage modifiée (1:100 w/w; Sigma Aldrich). Les échantillons digérés ont été purifiés à l'aide de cartouches C18 en phase inverse conformément aux instructions du fabricant. L'élution des peptides a été réalisée avec 30% d'ACN dans 0,1% de TFA, les peptides ont été congelés pendant une nuit à -80 ° C, puis lyophilisés pendant 96 h.

Les peptides lyophilisés ont été dissous dans du tampon AP (TrisHCl 50 mM [pH 8, 0], MgCl2 1 mM, DTT 250 μM et NaCl 50 mM) et environ 2 mg de peptide ont été utilisés pour chaque expérience répétée. Les échantillons ont été incubés avec Af1521 et laissés en rotation tête-bêche à 4 ° C pendant 4 h. Les billes ont été lavées deux fois dans du tampon AP glacé fraîchement préparé, deux fois dans du PBS glacé avec du DTT et deux fois dans de l'eau MQ glacée, avec un changement de tube à chaque changement de tampon. Les peptides modifiés par ADPr ont été élués des billes par addition de TFA à 0,15 % glacé. Les peptides élués ont été passés à travers des filtres de centrifugation de 0,45 μm, puis à travers des filtres de centrifugation prélavés de 100 kDa (Vivacon 500, Satorius), après quoi ils ont été fractionnés à pH élevé en trois fractions et un F012, 50, 51, 53 supplémentaire. .

Toutes les expériences MS ont été analysées sur un système HPLC EASY-nLC 1200 (Thermo) connecté à un spectromètre de masse Fusion Lumos Orbitrap (Thermo). Chaque échantillon a été séparé sur une colonne analytique de 15 cm, d'un diamètre interne de 75 μm, garnie en interne de billes C18 de 1,9 μm (ReproSil-Pur-AQ, Dr. Maisch) et chauffée à 40 °C à l'aide d'un four à colonne. . La séparation des peptides a été effectuée à l'aide d'un gradient de 60 min à un débit de 250 nL/min, en utilisant le tampon A constitué de 0,1 % de FA et le tampon B constitué de 80 % d'ACN dans 0,1 % de FA. Le spectromètre de masse a fonctionné en mode d'acquisition dépendant des données, avec des balayages complets effectués à une résolution de 120 000 et un temps d'injection maximal de 250 ms. La fragmentation des précurseurs a été réalisée en utilisant la dissociation par transfert d'électrons avec une dissociation supplémentaire par collision supérieure (EThcD), avec une énergie d'activation supplémentaire de 20. Les précurseurs avec l'état de charge 3 à 5 ont été inclus et classés par ordre de priorité de la charge 3 (la plus élevée) à la charge 5 (la plus faible), en utilisant l'algorithme de l'arbre de décision. Les précurseurs sélectionnés ont été exclus du séquençage répété en définissant une exclusion dynamique de 45 s. Les spectres MS/MS ont été mesurés dans l'Orbitrap, avec un temps d'injection de précurseur maximal de 500 ms et une résolution de balayage de 60 000. Toutes les données brutes MS ont été analysées à l'aide de la suite logicielle MaxQuant version 1.5.3.3076 et recherchées par rapport au protéome de Drosophila au format de fichier FASTA, tel que téléchargé à partir d'UniProt le 11 novembre 2020. Les paramètres MaxQuant par défaut ont été utilisés, à l'exception des suivants : cystéine carbamidométhylation, et l'ADP-ribosylation sur les résidus cystéine, acide aspartique, acide glutamique, histidine, lysine, arginine, sérine, thréonine et tyrosine ont été inclus en tant que modifications variables. Le score delta d'Andromède a été fixé au minimum à 20 pour les peptides modifiés.

Le traitement statistique des données a été principalement effectué à l'aide du logiciel Perseus disponible gratuitement77, et comprend l'analyse des composants principaux et l'analyse des parcelles volcaniques. Les annotations Protein Gene Ontology ont été réalisées à l'aide de DAVID Bioinformatics Resources78. L'analyse du contexte de la séquence a été réalisée à l'aide du logiciel iceLogo79.

L'analyse d'interférence d'ARN a été effectuée comme décrit précédemment dans la réf. 80, 81. Les nucléotides 34 à 367 de l'ADNc de dParg ont été choisis comme cibles de dsPARG-1 à l'aide de SnapDragon (https://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl). Les cibles de dsPARG-2 (769-1275) et de dsLacZ ont été produites comme décrit précédemment dans la réf. 32. Les oligonucléotides permettant de générer des matrices pour les ARNdb par PCR sont donnés dans les données supplémentaires 3. Les ARNdb ont été préparés à l'aide du kit MEGAscript T7 (Thermo Fisher Scientific, AM1334) conformément aux instructions du fabricant. L'ARN a été dénaturé à 65°C pendant 30 min puis annelé par refroidissement lent à 4°C. 10 μg d'ARNdb ont été ajoutés pour 1 × 106 cellules. Les cellules ont été récoltées pendant 5 jours après le traitement par l'ARNdb, suivi de l'induction des dommages à l'ADN à l'aide de H2O2 comme décrit ci-dessus ou d'une analyse par transcriptase inverse-réaction en chaîne par polymérase quantitative (RT-qPCR) comme décrit ci-dessous.

Les ARN totaux des cellules S2R+ ont été purifiés avec le kit RNeasy Plus Mini (QIAGEN) puis 0,5 µg d'ARN total ont été utilisés pour la synthèse d'ADNc avec le kit de transcription inverse QuantiTect selon les instructions du fabricant. Les ADNc ont été détectés par PCR quantitative en temps réel à l'aide du kit Rotor-Gene SYBR Green PCR et du Rotor-Gene Q (QIAGEN). Les paires d'amorces pour RT-qPCR sont données dans les données supplémentaires 3. L'analyse relative de l'expression génique du gène dParg a été réalisée à l'aide de la méthode ddCt.

Prism 9.1 (GraphPad) a été utilisé pour l'analyse statistique, où ****p < 0,0001. Les détails des analyses statistiques sont décrits dans la légende de la Fig. 4.

Les vecteurs d'expression pour hARH3, hTARG1, hHPF1, hPARP1 et hPARG ont été décrits précédemment5,15,54,63. La séquence codante de dParp, dParg, dTarg1-3 et dHpf1 a été amplifiée à partir d'ADNc préparé à partir de cellules S2R + à l'aide d'oligonucléotides répertoriés dans les données supplémentaires 3 et clonée dans des plasmides d'expression pET28a avec une étiquette His N-terminale. Toutes les mutations indiquées ont été introduites par mutagenèse dirigée basée sur la PCR (données supplémentaires 3). L'expression a été réalisée dans des cellules E. coli Rosetta (DE3) (Novagen) et du milieu Terrific Broth additionné de 30 μg/ml de kanamycine et 30 μg/ml de chloramphénicol. Les cellules ont été cultivées à 37 ° C et la croissance s'est arrêtée lorsque la culture a atteint OD600 ~ 0,6. Les cultures ont ensuite été induites avec de l'IPTG 1 mM et incubées à 18°C ​​pendant une nuit. Les cellules ont été centrifugées pendant 10 min à 3000 x g et les culots remis en suspension dans du tampon A (TrisHCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, TCEP 1 mM, imidazole 10 mM) additionné de 1 × cocktail d'inhibiteurs de protéase sans EDTA cOmplete (Roche ) et 250 U de benzonase nucléase (Sigma) pour 1 L de culture cellulaire. Toutes les étapes de purification suivantes ont été réalisées à 4°C. La lyse a été effectuée à l'aide d'un homogénéisateur et les débris cellulaires ont été séparés par centrifugation à 35 000 x g pendant 60 min. Le surnageant a ensuite été incubé avec de la résine Ni-NTA (Qiagen) pré-équilibrée avec du tampon A, pendant 30 min. La suspension a été transférée dans une colonne à écoulement par gravité vide (BioRad) et la résine a été lavée avec 10 volumes de colonne de tampon A avant l'élution avec le tampon A additionné d'imidazole 300 mM. Les protéines éluées ont été dialysées contre du TrisHCl 25 mM (pH 8), du NaCl 500 mM et du DTT 1 mM à 4 ° C, pendant une nuit. Les protéines ont ensuite été concentrées et soumises à une chromatographie d'exclusion stérique à l'aide d'une colonne HiLoad 16/60 Superdex 75 équilibrée avec du TrisHCl 10 mM (pH 8), du NaCl 100 mM, du TCEP 0,2 mM pour dParg et dTarg1-3, ou du TrisHCl 10 mM ( pH 8), NaCl 100 mM, TCEP 0,1 mM pour dTarg1-3 et dHpf1, respectivement. Le dParg élué et le dTargl-3 ont été concentrés à 8 mg/ml et le dHpfl à 9 mg/ml. La qualité des protéines a été évaluée pour chaque étape par SDS-PAGE. Toutes les autres protéines ont été exprimées et purifiées comme décrit précédemment : hPARG62, hHPF115, hPARP1 de type sauvage et le mutant E988Q82, hARH1, hARH2, hARH383 et l'histone H3/H484. Le peptide histone H3 (aa 1–21) a été acheté chez Sigma (SaintLouis, MO, US).

L'ADPr a été réalisée comme décrit précédemment25. En bref, des protéines ou des peptides recombinants ont été ADP-ribosylés par hPARP1 pour produire Glu-ADPr ou par hPARP1:hHPF1 pour produire Ser-ADPr. Les réactions ont été réalisées dans du TrisHCl 50 mM (pH 8), du NaCl 100 mM, du MgCl2 2 mM, de l'ADN activé et du NAD+ 50 µM additionné de 32P-NAD+. La réaction hPARP1 a été effectuée à température ambiante pendant 30 min et arrêtée par l'ajout de 1 µM d'olaparib. Des protéines ADP-ribosylées ont été utilisées comme substrat pour les dosages successifs de (ADP-ribosyl)hydrolase. Le substrat a été incubé à température ambiante pendant 30 minutes avec les (ADP-ribosyl)hydrolases indiquées et analysé par SDS-PAGE et autoradiographie. Les concentrations de hPARP1 et hHPF1 par réaction étaient de 0, 5 μM, la (ADP-ribosyl) hydrolase était de 1 μM, l'histone tétramère H3 / H4 de 2 μM et les peptides d'histone de 0, 5 μg.

Le test a été effectué comme décrit précédemment58,59,60. En bref, la concentration du peptide synthétique mono-Ser-ADPr H2B59 a été estimée en utilisant l'absorbance à λ260nm avec un coefficient d'extinction molaire de 13 400 M-1 cm-1 pour la modification ADP-ribosyle. Le peptide 8 μM a été démodifié par incubation avec 1 μM d'hydrolase indiquée pendant 30 min à 30 ° C dans un tampon de test (TrisHCl 50 mM [pH 8], NaCl 200 mM, MgCl2 10 mM, dithiothréitol 1 mM et NudT585 humain 0, 2 μM). Les réactions ont été stoppées et analysées en réalisant le test AMP-Glo™ (Promega) selon le protocole du fabricant. La luminescence a été enregistrée sur un lecteur de plaques SpectraMax M5 (Molecular Devices) et les données analysées avec GraphPad Prism 9.1. Pour le bruit de fond, la réaction de soustraction a été effectuée en l'absence d'hydrolase.

Le peptide Histone H3 a été Ser-ADP-ribosylé comme ci-dessus, sauf que des concentrations plus élevées de substrat ont été utilisées. Les peptides Ser-ADP-ribosylés ont été davantage purifiés en filtrant la réaction en utilisant une colonne de concentration avec un seuil de coupure de 10 kDa (Millipore). L'excès de NAD + a été éliminé à l'aide d'une colonne de centrifugation G25 (GE HealthCare, Royaume-Uni).

Les alignements de séquences HPF1 d'espèces métazoaires et protozoaires (données supplémentaires 1) ont été générés à l'aide de JalView v. 2.1186 et le domaine HPF extrait de leur contexte séquentiel basé sur l'alignement Mafft L-INS-i87 en utilisant des données cristallographiques pour déterminer les limites de domaine. Les séquences extraites ont été réalignées à l'aide de l'algorithme Mafft L-INS-i. Les histoires évolutives du domaine HPF ont été déduites en utilisant la méthode du maximum de vraisemblance et le modèle Le_Gascuel_200888 avec un arbre initial obtenu automatiquement pour la recherche heuristique en appliquant la méthode du maximum de parcimonie. L'analyse a été effectuée en utilisant une couverture du site de 95 % avec l'option de suppression partielle. Les niveaux de confiance ont été estimés à l'aide de 1000 cycles de la méthode bootstrap. Des analyses évolutives ont été menées dans MEGA1189.

Les alignements des séquences PARP et PARG (tableaux supplémentaires 1 et 3) ont été générés à l'aide de JalView v. 2.11 à l'aide de l'algorithme Mafft L-INS-i mis en œuvre.

Des essais de cristallisation ont été effectués à 4 ° C avec des écrans commerciaux utilisant la méthode de diffusion de vapeur à l'aide d'un robot Mosquito Crystal (TTP Labtech) en utilisant des gouttes assises de 150 nl de solution protéique dans des microplaques de cristallisation à deux puits MRC (Swissci) équilibrées avec 150 nl réservoir. Des cristaux de dParg ont été cultivés dans du PEG3350 à 19 % (p/v), du sulfate de sodium 210 mM, du propane Bis-Tris 0,1 M (pH 7,2). Les cristaux de dParg en complexe avec l'inhibiteur PDD00017273 ont poussé dans les mêmes conditions, sauf que PDD00017273 a été ajouté à la solution de protéines à une concentration de 0, 5 mM avant la cristallisation. Tous les cristaux ont été cryoprotégés dans du glycérol à 15 % (v/v) dans la liqueur mère avant d'être vitrifiés par immersion dans de l'azote liquide. La collecte de données a été effectuée sur les lignes de lumière I04 et I24 de la Diamond Light Source (Rutherford Appleton Laboratory, Harwell, Royaume-Uni).

Les données radiographiques ont été traitées à l'aide de Xia290. PHASER91 a été utilisé pour des essais de remplacement moléculaire avec hPARG (PDB : 6HMK) comme modèle de remplacement moléculaire. La modification de la densité a été effectuée avec PARROT92 et les modèles initiaux ont été construits à l'aide du programme de construction de modèles automatisé BUCCANEER93. La construction de modèles pour toutes les structures a été réalisée avec COOT94 et le raffinement de l'espace réel avec REFMAC595, couplé à des contraintes de symétrie non cristallographiques locales générées automatiquement et à un raffinement TLS. Les statistiques pour les complexes dParg et dParg:PDD00017273 sont présentées dans le tableau supplémentaire 2.

Les cellules de Drosophila S2R + ont été étalées sur une lame de chambre ibiTreat à 8 puits (ibidi) et transfectées 48 h avant l'imagerie à l'aide de FugeneHD conformément aux instructions du fabricant. Pour la sensibilisation cellulaire avant l'irradiation laser à 405 nm, le milieu de croissance a été aspiré de la lame de la chambre et remplacé par un milieu frais contenant 0,3 μg/mL Hoechst 33342. Immédiatement avant l'imagerie, le milieu contenant Hoechst a été remplacé par un milieu de croissance frais. La microscopie des cellules vivantes a été réalisée sur un microscope inversé Olympus IX-83 équipé d'une tête à disque rotatif à super résolution Yokogawa SoRa, d'un objectif à immersion dans l'huile UPlanAop 60x/1,5 NA pour les expériences de microirradiation, d'un UPlanXApo 100×/1,35 NA pour des expériences de localisation de protéines et une caméra Prime BSI sCMOS. La fluorescence de Hoechst et de l'EGFP a été excitée avec un laser à semi-conducteurs de 405 nm et 488 nm respectivement et la détection de fluorescence a été réalisée avec des filtres passe-bande adaptés aux spectres d'émission des fluorophores. Une microirradiation laser à 405 nm a été réalisée le long d'une ligne de 7 µm à travers le noyau pendant 250 ms à l'aide d'une tête de balayage à point unique (Olympus cellFRAP) couplée au panneau arrière à épifluorescence du microscope. Pour assurer la reproductibilité, la puissance laser à 405 nm a été mesurée au début de chaque expérience et réglée à 110 µW au niveau de l'échantillon. Pour les expériences d'évolution dans le temps, les images ont été collectées toutes les 2 s. Pour les expériences d'imagerie de cellules vivantes, les cellules ont été maintenues à 25 ° C avec une chambre chauffante. L'accumulation de protéines aux sites de dommages (Ad) a ensuite été calculée comme suit :

L'intensité dans la zone microirradiée a ensuite été normalisée à l'intensité avant l'induction des dommages.

Pour les images de localisation des protéines, des cellules de Drosophila S2R+ transfectées avec des protéines marquées à l'EGFP ont été incubées dans un milieu contenant 1 μg/mL de Hoechst 33342 pendant 30 min. Les milieux contenant Hoechst ont été remplacés par des milieux de croissance frais avant l'imagerie.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les coordonnées atomiques incluses dans l'étude ont été déposées dans la Protein Data Bank (PDB) avec les codes d'accès suivants : apo dParg, 8ADK [https://doi.org/10.2210/pdb8adk/pdb] ; complexe dParg:PARGi, 8ADJ [https://doi.org/10.2210/pdb8adj/pdb]. Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE96 avec l'identifiant de jeu de données PXD036512. Des images complètes des transferts et du gel ainsi que des données utilisées pour générer des graphiques peuvent être trouvées dans le fichier de données source. Les données sources sont fournies avec ce document.

Toutes les constructions générées dans cette étude sont disponibles sur demande et seront remplies par le contact principal avec un accord de transfert de matériaux rempli.

Kim, DS, Challa, S., Jones, A. & Kraus, WL PARP et ADP-ribosylation dans la biologie de l'ARN : de l'expression et du traitement de l'ARN à la traduction des protéines et à la protéostase. Gènes Dév. 34, 302–320 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luscher, B. et al. ADP-ribosylation, une modification post-traductionnelle à multiples facettes impliquée dans le contrôle de la physiologie cellulaire dans la santé et la maladie. Chim. Rév. 118, 1092–1136 (2018).

Article PubMed Google Scholar

Mikolcevic, P., Hlousek-Kasun, A., Ahel, I. & Mikoc, A. Systèmes de ribosylation ADP dans les bactéries et les virus. Calcul. Structure. Biotechnol. J. 19, 2366-2383 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Palazzo, L., Suskiewicz, MJ & Ahel, I. Serine ADP-ribosylation dans la régulation de la réponse aux dommages à l'ADN. Courant. Avis. Genet Dév. 71, 106-113 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Vyas, S. et al. Analyse à l'échelle de la famille de l'activité poly(ADP-ribose) polymérase. Nat. Commun. 5, 4426 (2014).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

D'Amours, D., Desnoyers, S., D'Silva, I. & Poirier, GG Réactions de poly(ADP-ribosyl)ation dans la régulation des fonctions nucléaires. Biochem J. 342, 249–268 (1999).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Eisemann, T. & Pascal, JM Enzymes polymérases poly(ADP-ribose) et maintien de l'intégrité du génome. Cellule Mol. Vie Sci. 77, 19–33 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Prokhorov, E. et al. La poly-ADP-ribosylation non restreinte donne un aperçu de la régulation de la chromatine et des maladies humaines. Mol. Cellule 81, 2640–2655.e8 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martin-Hernandez, K., Rodriguez-Vargas, JM, Schreiber, V. & Dantzer, F. Extension des fonctions de l'ADP-ribosylation dans le maintien de l'intégrité du génome. Dév. Biol. 63, 92–101 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Purnell, MR, Stone, PR & Whish, WJ ADP-ribosylation des protéines nucléaires. Biochem Soc. Trans. 8, 215–227 (1980).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bonfiglio, JJ et al. L'ADP-ribosylation de la sérine dépend de HPF1. Mol. Cellule 65, 932–940.e6 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Larsen, SC, Hendriks, IA, Lyon, D., Jensen, LJ & Nielsen, ML L'analyse à l'échelle du système de la sérine ADP-ribosylation révèle une occurrence généralisée et un chevauchement spécifique au site avec la phosphorylation. Cell Rep. 24, 2493–2505.e4 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Leidecker, O. et al. La sérine est un nouveau résidu cible pour l'ADP-ribosylation endogène sur les histones. Nat. Chim. Biol. 12, 998-1000 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Palazzo, L. et al. La sérine est le principal résidu de l'ADP-ribosylation lors de dommages à l'ADN. Elife 7 (2018).

Gibbs-Seymour, I., Fontana, P., Rack, JGM & Ahel, I. HPF1/C4orf27 est une protéine interagissant avec PARP-1 qui régule l'activité de ribosylation ADP-PARP-1. Mol. Cellule 62, 432–442 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bilokapic, S., Suskiewicz, MJ, Ahel, I. & Halic, M. Le pontage des cassures d'ADN active PARP2-HPF1 pour modifier la chromatine. Nature 585, 609–613 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun, FH et al. HPF1 remodèle le site actif de PARP1 pour permettre la sérine ADP-ribosylation des histones. Nat. Commun. 12, 1028 (2021).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Suskiewicz, MJ et al. HPF1 complète le site actif PARP pour la ribosylation de l'ADP induite par les dommages à l'ADN. Nature 579, 598–602 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bartlett, E. et al. Interaction des marques d'histone avec la sérine ADP-ribosylation. Cell Rep. 24, 3488–3502.e5 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Leslie Pedroli, DM et al. Une analyse complète de l'ADP-ribosylome identifie la tyrosine comme site accepteur de l'ADP-ribose. EMBO Rep 19 (2018).

Rack, JGM, Palazzo, L. & Ahel, I. (ADP-ribosyl)hydrolases : structure, fonction et biologie. Gènes Dév. 34, 263-284 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin, W., Ame, JC, Aboul-Ela, N., Jacobson, EL & Jacobson, MK Isolement et caractérisation de l'ADNc codant pour la poly(ADP-ribose) glycohydrolase bovine. J. Biol. Chim. 272, 11895–11901 (1997).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rack, JGM et al. Aperçu mécaniste des trois étapes de l'inversion de la poly (ADP-ribosylation). Nat. Commun. 12, 4581 (2021).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Slade, D. et al. La structure et le mécanisme catalytique d'une poly(ADP-ribose) glycohydrolase. Nature 477, 616–620 (2011).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fontana, P. et al. Inversion de l'ADP-ribosylation de la sérine par l'hydrolase ARH3. Elife 6 (2017).

Hanzlikova, H. et al. Les mutations pathogènes ARH3 entraînent des cicatrices de chromatine ADP-ribose lors de la réparation de rupture de brin d'ADN. Nat. Commun. 11, 3391 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schutzenhofer, K., Rack, JGM & Ahel, I. La fabrication et la rupture de la sérine-ADP-ribosylation dans la réponse aux dommages à l'ADN. Dév Cellule Front. Biol. 9, 745922 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Smith, R. et al. L'ADP-ribosylation de l'histone HPF1-dépendante déclenche la relaxation de la chromatine pour favoriser le recrutement de facteurs de réparation sur les sites de dommages à l'ADN. Nat Struct Mol Biol 5, 678–691 (2023).

Mateo, J. et al. Une décennie de développement clinique des inhibiteurs de PARP en perspective. Ann. Oncol. 30, 1437-1447 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prokhorov, E. et al. L'auto-modification PARP1 liée à la sérine contrôle la réponse des inhibiteurs de PARP. Nat. Commun. 12, 4055 (2021).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Miwa, M., Hanai, S., Yamashita, S., Tanaka, M. & Uchida, K. Drosophila melanogaster comme modèle pour comprendre la polyADP-ribosylation. Avant Biosci. (Landmark Ed.) 25, 118–133 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ishak, L. et al. Le maintien de l'ADN après des ruptures de brin induites par la bléomycine ne nécessite pas l'activation de la poly(ADP-ribosyl)ation dans les cellules de Drosophila S2. Réparation de l'ADN (Amst.) 48, 8–16 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bordet, G., Lodhi, N., Guo, D., Kossenkov, A. & Tulin, AV Poly(ADP-ribose) polymérase 1 dans le contrôle de l'expression à l'échelle du génome chez la drosophile. Sci. Rep. 10, 21151 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kotova, E., Jarnik, M. & Tulin, AV Découplage des fonctions de transactivation et de transrépression de la protéine PARP1. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 107, 6406–6411 (2010).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, MY, Mauro, S., Gevry, N., Lis, JT & Kraus, WL Modulation dépendante du NAD+ de la structure de la chromatine et de la transcription par les propriétés de liaison au nucléosome de PARP-1. Cellule 119, 803–814 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pinnola, A., Naumova, N., Shah, M. & Tulin, AV Les histones du noyau nucléosomal médient la régulation dynamique de la liaison de la protéine poly(ADP-ribose) polymérase 1 à la chromatine et l'induction de son activité enzymatique. J. Biol. Chim. 282, 32511–32519 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Thomas, C. et al. Hit and run versus activation à long terme de PARP-1 par ses différents domaines affine les processus nucléaires. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 116, 9941–9946 (2019).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tulin, A., Naumova, NM, Menon, AK & Spradling, AC Drosophila poly(ADP-ribose) glycohydrolase médie la structure de la chromatine et le silençage dépendant de SIR2. Génétique 172, 363–371 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tulin, A. & Spradling, A. Relâchement de la chromatine par la poly(ADP)-ribose polymérase (PARP) aux loci de la bouffée de Drosophila. Sciences 299, 560-562 (2003).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Tulin, A., Stewart, D. & Spradling, AC Le gène hétérochromatique de Drosophila codant pour la poly(ADP-ribose) polymérase (PARP) est nécessaire pour moduler la structure de la chromatine au cours du développement. Gènes Dév. 16, 2108-2119 (2002).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hanai, S. et al. La perte de poly (ADP-ribose) glycohydrolase provoque une neurodégénérescence progressive chez Drosophila melanogaster. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 101, 82–86 (2004).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Lehmann, S. et al. L'amélioration du métabolisme de récupération du NAD+ est neuroprotectrice dans un modèle PINK1 de la maladie de Parkinson. Biol Ouvert 6, 141-147 (2017).

Lehmann, S., Costa, AC, Celardo, I., Loh, SH & Martins, LM Les mutations de Parp protègent contre le dysfonctionnement mitochondrial et la neurodégénérescence dans un modèle PARKIN de la maladie de Parkinson. Mort cellulaire Dis. 7, e2166 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, Y. et al. Les mutations de Parp protègent de la toxicité mitochondriale dans la maladie d'Alzheimer. Mort cellulaire Dis. 12, 651 (2021).

Duan, Y. et al. La PARylation régule la dynamique des granules de stress, la séparation des phases et la neurotoxicité des protéines de liaison à l'ARN liées à la maladie. Cell Res 29, 233–247 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, C., Vyas, A., Kassab, MA, Singh, AK & Yu, X. Le rôle de la poly ADP-ribosylation dans la première vague de réponse aux dommages à l'ADN. Nucleic Acids Res 45, 8129–8141 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ji, Y., Jarnik, M. & Tulin, AV La poly(ADP-ribose) glycohydrolase et la protéine d'interaction poly(ADP-ribose) Hrp38 régulent la formation de motifs au cours du développement des yeux de la drosophile. Gène 526, 187-194 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ji, Y. & Tulin, AV La poly(ADP-ribosyl)ation de ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes module l'épissage. Nucleic Acids Res 37, 3501–3513 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

James, DI et al. Des sondes chimiques de première classe contre la poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) inhibent la réparation de l'ADN avec une pharmacologie différentielle par rapport à l'olaparib. ACS Chem. Biol. 11, 3179–3190 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hendriks, IA et al. Le paysage réglementaire de l'ADP-ribosylome humain dépendant de HPF1 et ARH3. Nat. Commun. 12, 5893 (2021).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hendriks, IA, Larsen, SC & Nielsen, ML Une stratégie avancée pour le profilage complet des sites d'ADP-ribosylation à l'aide de la protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Mol. Protéine cellulaire. 18, 1010-1026 (2019).

Article CAS Google Scholar

Martello, R. et al. Identification à l'échelle du protéome de l'ADP-ribosylome endogène des cellules et tissus de mammifères. Nat. Commun. 7, 12917 (2016).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Buch-Larsen, SC, Rebak, A., Hendriks, IA et Nielsen, ML Dynamique de l'ADP-ribosylation temporelle et spécifique au site lors de différents stress génotoxiques. Cellules 10 (2021).

Sharifi, R. et al. Déficit en terminal ADP-ribose protéine glycohydrolase TARG1/C6orf130 dans les maladies neurodégénératives. EMBO J. 32, 1225-1237 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Perina, D. et al. Distribution des systèmes de poly(ADP-ribosyl)ation des protéines dans tous les domaines de la vie. Réparation de l'ADN (Amst.) 23, 4–16 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gagné, JP et al. Profilage quantitatif de l'ADP-ribosylation spécifique au site des PARP dépendantes de l'ADN. Réparation de l'ADN (Amst.) 30, 68–79 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Marsischky, GT, Wilson, BA & Collier, RJ Rôle de l'acide glutamique 988 de la poly-ADP-ribose polymérase humaine dans la formation de polymères. Preuve de similitudes de sites actifs avec les toxines ADP-ribosylantes. J. Biol. Chim. 270, 3247–3254 (1995).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rack, JGM & Ahel, I. Une méthode simple pour étudier l'inversion de l'ADP-ribosylation : de la fonction à la découverte de médicaments. Méthodes Mol. Biol. 2609, 111-132 (2023).

Article PubMed Google Scholar

Voorneveld, J. et al. Peptides synthétiques alpha- et bêta-Ser-ADP-ribosylés révélant l'alpha-Ser-ADPr comme épimère natif. Org. Lett. 20, 4140–4143 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Voorneveld, J. et al. Outils moléculaires pour l'étude de l'ADP-ribosylation : une méthode unifiée et polyvalente pour synthétiser des peptides mono-ADP-ribosylés natifs. Chimie 27, 10621–10627 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dunstan, MS et al. Structure et mécanisme d'une poly(ADP-ribose) glycohydrolase canonique. Nat. Commun. 3, 878 (2012).

Article ADS PubMed Google Scholar

Lambrecht, MJ et al. Synthèse de l'ADP-ribose dimère et sa structure avec la poly(ADP-ribose) glycohydrolase humaine. Confiture. Chim. Soc. 137, 3558–3564 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tucker, JA et al. Les structures du domaine catalytique de la poly (ADP-ribose) glycohydrolase humaine confirment le mécanisme catalytique et expliquent l'inhibition par les dérivés de l'ADP-HPD. PLoS One 7, e50889 (2012).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Z., Gagné, JP, Poirier, GG & Xu, W. Analyse cristallographique et biochimique de la poly(ADP-ribose) glycohydrolase de souris. PLoS One 9, e86010 (2014).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Daniels, CM, Ong, SE & Leung, AK Approche phosphoprotéomique pour caractériser les sites de mono- et poly(ADP-ribosyl)ation de protéines à partir de cellules. J. Proteome Res 13, 3510–3522 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y., Wang, J., Ding, M. & Yu, Y. Caractérisation spécifique au site du protéome Asp- et Glu-ADP-ribosylé. Nat. Méthodes 10, 981–984 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Leutert, M. et al. La Caractérisation Protéomique Du Coeur Et Du Muscle Squelettique Révèle L'ADP-Ribosylation De L'arginine Répandue Par L'ectoenzyme ARTC1. Cell Rep. 24, 1916–1929.e5 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rodriguez, KM et al. La génétique chimique et la cartographie du site à l'échelle du protéome révèlent la MARylation de la cystéine par PARP-7 sur des cibles protéiques pertinentes pour le système immunitaire. Elife 10 (2021).

Beijer, D. et al. Les mutations bialléliques ADPRHL2 dans la neuropathie complexe affectent la ribosylation de l'ADP et la réponse aux dommages à l'ADN. Life Sci Alliance 4 (2021).

Danhauser, K. et al. Les mutations bi-alléliques ADPRHL2 provoquent une neurodégénérescence avec retard de développement, ataxie et neuropathie axonale. Suis. J. Hum. Genet. 103, 817–825 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ghosh, SG et al. Les mutations bialléliques dans ADPRHL2, codant pour l'ADP-ribosylhydrolase 3, conduisent à un syndrome d'ataxie épileptique induite par le stress pédiatrique dégénératif. Suis. J. Hum. Genet. 103, 431–439 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kong, L. et al. La mono(ADP-ribosyl)ation non canonique des protéines SZF à doigt de zinc contrecarre l'ubiquitination pour l'homéostasie des protéines dans l'immunité des plantes. Mol. Cellule 81, 4591–4604.e8 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Feng, B. et al. La poly(ADP-ribosyl)ation des protéines régule l'expression des gènes immunitaires et les réponses de défense d'Arabidopsis. PLoS Genet. 11, e1004936 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

St-Laurent, JF, Gagnon, SN, Dequen, F., Hardy, I. & Desnoyers, S. Réponse altérée aux dommages à l'ADN chez Caenorhabditis elegans avec expression altérée des gènes de poly(ADP-ribose) glycohydrolases. Réparation de l'ADN (Amst.) 6, 329–343 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Buch-Larsen, SC et al. Cartographie de l'ADP-ribosylation physiologique à l'aide de la dissociation par transfert d'électrons d'ions activés. Cell Rep. 32, 108176 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cox, J. & Mann, M. MaxQuant permet des taux d'identification de peptides élevés, des précisions de masse individualisées en ppb et une quantification des protéines à l'échelle du protéome. Nat. Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tyanova, S. et al. La plate-forme informatique Perseus pour une analyse complète des données (proté)omiques. Nat. Méthodes 13, 731–740 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sherman, BT et al. DAVID : un serveur web pour l'analyse d'enrichissement fonctionnel et l'annotation fonctionnelle de listes de gènes (mise à jour 2021). Acides nucléiques Res W1, W216–W221 (2022).

Colaert, N., Helsens, K., Martens, L., Vandekerckhove, J. & Gevaert, K. Visualisation améliorée des séquences consensus de protéines par iceLogo. Nat. Méthodes 6, 786–787 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kulkarni, MM et al. Preuve d'effets hors cible associés aux longs ARNdb dans les tests cellulaires de Drosophila melanogaster. Nat. Méthodes 3, 833–838 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Suyari, O. et al. Identification du gène Drosophila Mes4 comme nouvelle cible du facteur de transcription DREF. Exp. Cell Res. 315, 1403-1414 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Langelier, MF, Planck, JL, Servent, KM et Pascal, JM Purification des domaines humains PARP-1 et PARP-1 d'Escherichia coli pour analyse structurale et biochimique. Méthodes Mol. Biol. 780, 209–226 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kernstock, S., Koch-Nolte, F., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, MS et Mueller-Dieckmann, C. Clonage, expression, purification, cristallisation et analyse préliminaire par diffraction des rayons X de l'ARH3 humain, le premier eucaryote protéine-ADP-ribosylhydrolase. Acta Crystallogr. Secte. F. Structure. Biol. Crist. Commun. 62, 224–227 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mehrotra, PV et al. Le facteur de réparation de l'ADN APLF est un chaperon d'histone. Mol. Cellule 41, 46–55 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Palazzo, L. et al. Traitement de la protéine ADP-ribosylation par les hydrolases Nudix. Biochem J. 468, 293–301 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Waterhouse, AM, Procter, JB, Martin, DM, Clamp, M. & Barton, GJ Jalview Version 2 - un éditeur d'alignement de séquences multiples et un atelier d'analyse. Bioinformatique 25, 1189-1191 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Katoh, K. & Toh, H. Parallélisation du programme d'alignement de séquences multiples MAFFT. Bioinformatique 26, 1899-1900 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Le, SQ & Gascuel, O. Une matrice générale améliorée de remplacement des acides aminés. Mol. Biol. Évol. 25, 1307-1320 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tamura, K., Stecher, G. & Kumar, S. MEGA11 : Analyse génétique évolutive moléculaire Version 11. Mol. Biol. Évol. 38, 3022–3027 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Winter, G., Lobley, CM & Prince, SM Prise de décision dans xia2. Acta Crystallogr D. Biol. Cristallologue. 69, 1260-1273 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Storoni, LC, McCoy, AJ & Read, RJ Fonctions de rotation rapide améliorées par la probabilité. Acta Crystallogr. D. Biol. Cristallologue. 60, 432–438 (2004).

Article PubMed Google Scholar

Cowtan, K. Développements récents dans la modification classique de la densité. Acta Crystallogr. D. Biol. Cristallologue. 66, 470–478 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cowtan, K. Le logiciel Buccaneer pour la construction de modèles automatisés. 1. Traçage des chaînes protéiques. Acta Crystallogr D. Biol. Cristallologue. 62, 1002–1011 (2006).

Article PubMed Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot : outils de création de modèles pour les graphiques moléculaires. Acta Crystallogr. D. Biol. Cristallologue. 60, 2126-2132 (2004).

Article PubMed Google Scholar

Murshudov, GN, Vagin, AA & Dodson, EJ Raffinement des structures macromoléculaires par la méthode du maximum de vraisemblance. Acta Crystallogr D. Biol. Cristallologue. 53, 240-255 (1997).

Article CAS PubMed Google Scholar

Perez-Riverol, Y. et al. Les ressources de la base de données PRIDE en 2022 : une plaque tournante pour les preuves protéomiques basées sur la spectrométrie de masse. Nucleic Acids Res. 50, D543–D552 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Télécharger les références

Nous remercions Luca Palazzo pour ses précieux conseils techniques, Andrea Mikoč pour ses commentaires critiques sur le manuscrit et Diamond Light Source pour l'accès aux lignes de lumière I04 et I24 (numéros de proposition mx12346 et mx18069). Nous remercions également Alan Wainman et le Dunn School Bioimaging Facility pour les conseils d'experts et l'accès au microscope confocal. OS a été soutenu par le programme de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) pour l'avancement des réseaux internationaux stratégiques visant à accélérer la circulation des chercheurs talentueux (S2802). Les travaux dans le laboratoire du MLN ont été en partie soutenus par le Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, la Novo Nordisk Foundation (NNF14CC0001 et NNF13OC0006477), le Conseil danois de la recherche indépendante (0135-00096 A, 2034-00311 A et 2032-00311 A), et la Société danoise du cancer (R325-A18824). La technologie protéomique appliquée faisait partie d'un projet qui a reçu un financement du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre de l'accord de subvention EPIC-XS-823839. Le travail dans le laboratoire d'IA a été soutenu par Wellcome Trust (101794 et 210634); Conseil de recherche en biotechnologie et sciences biologiques (BB/R007195/1); Alliance de recherche sur le cancer de l'ovaire (813369); et Cancer Research Royaume-Uni (C35050/A22284).

Marcin J. Suskiewicz

Present address: Centre de Biophysique Moléculaire, UPR4301 CNRS, rue Charles Sadron, CEDEX 2, F-45071, Orléans, France

Antonio Ariza

Adresse actuelle : School of Biosciences, University of Sheffield, Western Bank, Sheffield, S10 2TN, Royaume-Uni

Johannes Gregor Matthias Rack

Adresse actuelle : MRC Centre for Medical Mycology, School of Biosciences, University of Exeter, Geoffrey Pope Building, Exeter, EX4 4QD, Royaume-Uni

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Pietro Fontana, Sara C. Buch-Larsen, Osamu Suyari.

Sir William Dunn School of Pathology, Université d'Oxford, South Parks Road, Oxford, OX1 3RE, Royaume-Uni

Pietro Fontana, Osamu Suyari, Rebecca Smith, Marcin J. Suskiewicz, Kira Schützenhofer, Antonio Ariza, Johannes Gregor Matthias Rack et Ivan Ahel

Département de chimie biologique et de pharmacologie moléculaire, Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

Pierre Fontana

Programme de médecine cellulaire et moléculaire, Boston Children's Hospital, Boston, MA, États-Unis

Pierre Fontana

Programme de protéomique, Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, Faculté des sciences de la santé et de la médecine, Université de Copenhague, Blegdamsvej 3B, 2200, Copenhague, Danemark

Sara C. Buch-Larsen & Michael L. Nielsen

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

PF, SCB-L., OS, MJS, JGMR, MLN et IA ont conçu l'étude. PF a conçu et réalisé les études biochimiques. SCB-L. acquis et analysé les données de spectrométrie de masse. OS a réalisé les expériences de biologie cellulaire et les études de support de la biologie cellulaire KS. RS a effectué des expériences de microscopie. PF, MJS et AA ont résolu les structures cristallines. JGMR a effectué l'analyse phylogénétique, a soutenu les analyses et l'interprétation des données, PF, SCB-L., OS, AA, JGMR, MLN et IA ont rédigé le manuscrit, avec des contributions de tous les auteurs.

Correspondance avec Antonio Ariza, Johannes Gregor Matthias Rack, Michael L. Nielsen ou Ivan Ahel.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Georges Mer et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Fontana, P., Buch-Larsen, SC, Suyari, O. et al. L'ADP-ribosylation de la sérine chez la drosophile donne un aperçu de l'évolution de la signalisation réversible de l'ADP-ribosylation. Nat Commun 14, 3200 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38793-y

Télécharger la citation

Reçu : 14 septembre 2022

Accepté : 16 mai 2023

Publié: 02 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-38793-y

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.