Compétition interspécifique dans les biofilms oraux médiée par Streptococcus gordonii désoxyribonucléase extracellulaire SsnA

npj Biofilms et Microbiomes volume 8, Numéro d'article : 96 (2022) Citer cet article

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L'ADN extracellulaire (eDNA) est un composant clé de nombreux biofilms microbiens, y compris la plaque dentaire. Cependant, les rôles des enzymes extracellulaires de désoxyribonucléase (DNase) dans les biofilms sont mal compris. Streptococcus gordonii est un colonisateur pionnier de la plaque dentaire. Ici, nous avons identifié et caractérisé SsnA, une protéine associée à la paroi cellulaire responsable de l'activité DNase extracellulaire de S. gordonii. L'activité DNase extracellulaire médiée par SsnA de S. gordonii a été supprimée après la croissance des sucres. SsnA a été purifié en tant que protéine recombinante et s'est avéré inactif en dessous de pH 6,5. SsnA a inhibé la formation de biofilm par Streptococcus mutans d'une manière dépendante du pH. De plus, SsnA a inhibé la croissance des biofilms de microcosmes oraux dans la salive humaine. Cependant, l'inhibition a été améliorée par l'ajout de saccharose. Ensemble, ces données indiquent que S. gordonii SsnA joue un rôle clé dans la compétition interspécifique au sein des biofilms oraux. L'acidification du milieu par le catabolisme des sucres pourrait être une stratégie pour les espèces cariogènes telles que S. mutans pour empêcher l'exclusion médiée par SsnA des biofilms.

La cavité buccale abrite généralement entre environ 100 et 300 taxons bactériens différents qui colonisent les surfaces des tissus durs et mous1. La composition taxonomique et la distribution des bactéries au sein des biofilms oraux sont déterminées par des processus d'adhérence sélective, des interactions compétitives et mutualistes entre les espèces et l'environnement fourni par l'hôte2,3,4,5. L'accumulation de plaque dentaire, le biofilm formé à la surface des dents, se produit de manière spatio-temporelle ordonnée6. Les colonisateurs pionniers capables d'adhérer à la pellicule d'émail acquise constituent la base de la plaque dentaire et fournissent des récepteurs pour le recrutement de colonisateurs secondaires, ce qui conduit finalement au développement de communautés microbiennes complexes et dynamiques7,8. Les colonisateurs pionniers sont généralement considérés comme des commensaux ou même bénéfiques pour le maintien de la santé bucco-dentaire2,9,10. Cependant, si la plaque dentaire n'est pas correctement contrôlée, des caries dentaires ou des parodontites peuvent se développer11. Ces deux conditions sont responsables de la grande majorité des pertes de dents dans le monde12. La maladie est associée à des changements dans la composition et les activités biochimiques de la plaque dentaire qui entraînent un état de dysbiose13,14. Dans le cas des caries dentaires, la fréquence et/ou la quantité excessive de consommation de sucres alimentaires sélectionne des biofilms dysbiotiques enrichis en bactéries aciduriques et acidogènes qui réduisent le pH à la surface de la dent et entraînent la déminéralisation de l'émail dentaire ou du cément. La poursuite de la progression de la lésion entraîne la destruction de la dentine et l'invasion de bactéries dans la chambre pulpaire15,16.

Les colonisateurs pionniers tels que les streptocoques du groupe Mitis jouent un rôle important dans le contrôle de la prolifération de bactéries plus acidogènes et cariogènes telles que Streptococcus mutans. Par exemple, Streptococcus gordonii exprime un système arginine désaminase (AD) qui neutralise l'acidification du biofilm en générant de l'ammoniac et du dioxyde de carbone tout en produisant de l'énergie pour les cellules9,17,18,19,20. En présence d'oxygène, S. gordonii et d'autres membres du groupe de streptocoques Mitis, y compris Streptococcus sanguinis, produisent des quantités importantes (millimolaires) de peroxyde d'hydrogène (H2O2), qui peuvent inhiber la croissance de S. mutans21. De plus, il est possible que les colonisateurs pionniers entrent en compétition avec S. mutans pour les sites de liaison au sein du biofilm. L'attachement de S. mutans dépend fortement de la présence de saccharose, qui est métabolisé de manière extracellulaire pour produire des glucanes qui favorisent l'adhésion et la colonisation du biofilm22. En l'absence de saccharose, l'adhésion de S. mutans semble être médiée par l'ADN extracellulaire (eDNA)23. L'ADN extracellulaire est également important pour l'intégrité structurelle des biofilms matures de S. mutans puisque le traitement avec la DNase I entraîne la dispersion du biofilm24,25. Il a récemment été démontré que l'eDNA est présent dans des biofilms plus complexes, y compris la plaque dentaire d'espèces mixtes26,27,28,29,30,31. Le traitement de la plaque dentaire, en particulier aux premiers stades de développement, avec des enzymes DNase exogènes réduit significativement la biomasse du biofilm et appauvrit sélectivement certaines espèces qui semblent particulièrement dépendantes de l'eDNA27,31,32. De plus, l'eDNA sert de source de nutriments et de réservoir pour le transfert horizontal de gènes dans la plaque dentaire3,16.

De nombreuses bactéries produisent des enzymes désoxyribonucléases (DNase) liées à la surface ou sécrétées33,34. Dans les biofilms, les DNases extracellulaires remplissent diverses fonctions, notamment la dissémination des cellules bactériennes, le renouvellement de l'ADNe et le transfert horizontal de gènes8,35,36,37,38. Chez les agents pathogènes, les enzymes DNase extracellulaires sont souvent liées à la virulence et à l'évasion des réponses immunitaires de l'hôte telles que les pièges extracellulaires des neutrophiles (NET)39,40. Un certain nombre de bactéries buccales, dont S. gordonii, produisent des enzymes DNase extracellulaires33,34,41. Cependant, leurs fonctions dans le maintien du biofilm et les interactions interspécifiques sont mal comprises. Ici, nous avons identifié et caractérisé l'enzyme responsable de l'activité DNase extracellulaire de S. gordonii. De plus, nous avons étudié l'effet de cette enzyme sur le développement de biofilms de S. mutans ou de biofilms d'espèces mixtes plus complexes formés par des bactéries orales humaines.

Pour déterminer l'étendue de l'ADNe dans la matrice des biofilms S. gordonii DL1 et S. mutans GS-5, l'ADNe a été extrait de biofilms monospécifiques cultivés statiquement pendant 48 h. Une bande à haut poids moléculaire (> 10 kpb) a été observée dans les extraits isolés des biofilms de S. mutans mais pas dans les biofilms de S. gordonii (Fig. 1a). La taille du fragment était similaire à l'ADN chromosomique intracellulaire (ADNi) extrait des cellules de S. mutans. Cette bande n'a pas été observée après le traitement enzymatique des extraits avec la DNase I (Fig. 1 supplémentaire). L'analyse par spectrophotométrie NanoDrop des extraits a montré que l'ADNe représentait environ 19 % de l'ADN total (ADNi + ADNe) dans les biofilms de S. mutans alors qu'il ne représentait que 6 % de l'ADN total dans les biofilms de S. gordonii. Le rôle de l'ADNe dans le maintien de l'intégrité des biofilms de S. mutans et S. gordonii a été étudié en traitant des biofilms préformés de S. mutans et S. gordonii avec 5 µg/mL de DNase I pendant 1 h à 37 °C (Fig. 1b , c). La coloration au cristal violet a révélé que le traitement à la DNase I réduisait significativement la biomasse du biofilm de S. mutans de > 90 %. En revanche, les biofilms de S. gordonii n'ont pas été affectés par le traitement à la DNase I. L'inclusion de DNase I au cours du développement du biofilm a inhibé de manière significative l'accumulation de biofilms de S. mutans mais n'a pas affecté S. gordonii (Fig. 1d).

a Électrophorèse sur gel d'agarose d'ADN intracellulaire et extracellulaire (ADNi et eDNA) isolé de biofilms de S. gordonii et S. mutans. Les biofilms ont été cultivés pendant 48 h dans des plaques multipuits et les cellules ont été séparées de la matrice extracellulaire par centrifugation avant l'extraction de l'ADN. La flèche noire indique l'eDNA. Le marqueur (M) a été exécuté sur le même gel que les échantillons de S. gordonii mais séparé des voies d'échantillonnage. Les échantillons de S. mutans ont été analysés sur un gel différent. b Des biofilms préétablis de S. gordonii et S. mutans cultivés pendant 20 h dans du milieu BHY ont été traités avec 5 μg/mL de DNase I pendant 1 h à 37 °C. Les biofilms ont été colorés avec du cristal violet et la biomasse a été quantifiée en dissolvant le colorant et en mesurant l'absorbance à 570 nm. c Quantification des biofilms S. gordonii DL1 et S. mutans GS-5 colorés au cristal violet cultivés en présence et en l'absence de 5 μg/mL de DNase I. Les biofilms ont été cultivés en anaérobiose pendant 20 h dans BHY à 37 °CS biofilms mutans mais pas S . gordonii ont été inhibés lorsqu'ils ont été cultivés en présence de 5 μg/mL de DNase I. d La quantification de biofilms préformés de S. mutans traités avec 5 μg/mL de DNase I pendant 1 h à 37 °C a montré une réduction significative par le traitement à la DNase I ( dispersion), alors que les biofilms de S. gordonii n'étaient pas réduits. Les points de données sont affichés pour 4 à 6 expériences indépendantes, les barres représentent la moyenne et l'écart-type est indiqué. La distribution des données a réussi le test de normalité de Shapiro-Wilk et, par conséquent, la signification statistique a été calculée à l'aide du test t de Student ; ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Nous avons émis l'hypothèse que de faibles niveaux d'ADNe dans les biofilms de S. gordonii pourraient être dus à la production d'une enzyme DNase extracellulaire. Le criblage du génome de S. gordonii DL1 à l'aide de NCBI Blast a identifié trois gènes qui codent potentiellement des protéines avec des domaines de type DNase I. Parmi ceux-ci, les gènes codant pour une enzyme exonucléase III et une protéine marquée RgfB n'avaient pas les caractéristiques des protéines sécrétées. Le troisième gène (SGO_RS08090 ; GenBank Accession WP_012130709.1) a codé une protéine putative de 779 acides aminés avec un signal de sécrétion N-terminal et un motif LPxTG C-terminal pour l'ancrage médié par la sortase à la paroi cellulaire, indiquant une paroi cellulaire extracellulaire. enzyme liée (Fig. 2a). Compte tenu de l'homologie avec d'autres nucléases extracellulaires streptococciques, y compris SsnA de Streptococcus suis42, le gène putatif de DNase de S. gordonii a été appelé ssnA (Streptococcal Surface Nuclease A). Pour tester si le gène ssnA était responsable de l'activité de la DNase extracellulaire chez S. gordonii, ssnA a été éliminé et l'activité de la DNase extracellulaire a été évaluée à l'aide d'une gélose de test de DNase (Fig. 2b). Une zone de clairance était visible autour des colonies de S. gordonii de type sauvage indiquant que ces cellules produisaient de la DNase extracellulaire. En revanche, aucune activité de DNase extracellulaire n'a été détectée dans le mutant ∆ssnA. La complémentation génétique du gène ssnA sous son promoteur natif (S. gordonii ssnAComp) a restauré l'activité DNase (Fig. 2b).

a Diagramme schématique de l'organisation du domaine de la protéine codée par le gène ssnA. Les positions des domaines prédits comprenant un peptide signal putatif (SP), un pli OB, un domaine de nucléase et un motif d'ancrage de la paroi cellulaire LPxTG sont marquées avec des numéros de résidus d'acides aminés de début et de fin à partir de l'extrémité N-terminale. b L'activité extracellulaire de la DNase a été évaluée à l'aide de la DNase Test agar. Un halo clair autour des colonies de S. gordonii DL1 sauvage indique une activité DNase. Aucun halo n'était visible dans S. gordonii ΔssnA, alors que l'activité de DNase extracellulaire a été restaurée dans S. gordonii ssnAComp. c La fraction cellulaire et les milieux de culture usés ont été séparés par centrifugation de cultures planctoniques de S. gordonii de type sauvage, des souches mutantes ΔssnA et ssnAComp, et l'activité nucléase de chaque fraction a été déterminée à l'aide d'un dosage quantitatif basé sur la fluorescence. S. aureus FH7 a été inclus comme témoin. L'activité DNase extracellulaire de S. gordonii était principalement associée aux cellules, tandis que l'activité DNase de S. aureus était plus élevée dans le milieu conditionné. Des volumes identiques de fractions cellulaires et de surnageant ont été utilisés dans l'analyse. Les points de données sont affichés pour 3 répétitions indépendantes, les barres représentent la moyenne et SD est indiqué.

Pour explorer plus avant la production de SsnA chez S. gordonii, un test quantitatif d'activité DNase basé sur la fluorescence a été utilisé (Fig. 2c). L'activité DNase a été déterminée dans les fractions liées aux cellules et les surnageants. Staphylococcus aureus FH7, qui est connu pour libérer de la DNase dans le milieu extracellulaire, a été inclus comme témoin. Chez le S. gordonii de type sauvage, l'activité de la DNase était environ 5 fois plus élevée dans la fraction associée aux cellules que dans le milieu usé, ce qui indique que la majorité du SsnA sécrété reste lié à la paroi cellulaire. L'activité DNase était presque indétectable dans la fraction cellulaire et le milieu usé de S. gordonii ΔssnA. L'activité de la DNase extracellulaire a été restaurée dans la souche complémentée et était principalement associée à la fraction cellulaire.

Initialement, l'expression et l'activité de SsnA ont été surveillées par la croissance de S. gordonii dans BHY (Fig. 3a). Aucune différence significative dans l'activité SsnA associée aux cellules n'a été détectée entre 2 h et 25 h (Fig. 3b). L'expression génique de ssnA par rapport à l'expression du gène de l'ARNr 16S était également stable pendant la phase de croissance exponentielle. Cependant, l'expression a diminué pendant la phase stationnaire et a été significativement réduite de plus de 30 fois après 25 h (Fig. 3c).

a Courbe de croissance de S. gordonii cultivé en aérobiose dans du BHY à 37 °C. b L'activité DNase des cellules mesurée à 2, 4, 6 et 25 h à l'aide du dosage fluorescent quantitatif est indiquée. Des mesures de densité optique (OD600 nm) ont été utilisées pour la normalisation. c L'ARN a été extrait des échantillons à différents moments de la croissance pour évaluer l'expression de ssnA à l'aide de la RT-qPCR. Le changement de pli a été normalisé à l'expression du gène de l'ARNr 16S. Le résultat de 3 expériences indépendantes et SE sont présentés pour chaque essai. La distribution des données a réussi le test de normalité de Shapiro-Wilk. Une ANOVA unidirectionnelle ordinaire et des comparaisons multiples de Dunnett ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism 9 pour déterminer la signification statistique ; ****p < 0,0001.

L'analyse de la séquence de la région promotrice de ssnA a révélé un site de liaison consensus pour la protéine A du catabolite du carbone (CcpA), ou éventuellement pour la protéine MalR régulatrice du maltose (Fig. 2a supplémentaire). Pour déterminer si CcpA ou MalR jouent un rôle dans la régulation de l'expression de SsnA, des mutants ∆ccpA et ∆malR ont été construits et l'activité de DNase extracellulaire a été évaluée dans des souches cultivées en présence ou en l'absence de sucres ajoutés (Fig. 2b supplémentaire). Chez les bactéries Gram-positives telles que S. gordonii, la CCR est liée à l'absorption de sucres par le système sucre dépendant du phosphoénolpyruvate: phosphotransférase (PTS). La spécificité du substrat est déterminée par le composant de l'enzyme II (EII) du PTS. Le complexe S. gordonii EIIMan semble avoir une large spécificité de substrat43 et nous n'avons pas été en mesure d'identifier un sucre qui est utilisé par S. gordonii et qui ne déclenche pas de CCR (Lin Zeng, communication personnelle). Le SsnA purifié a été inclus comme ADN témoin et dégradé dans toutes les conditions testées, comme indiqué par une zone de clairance sur la gélose. Chez S. gordonii de type sauvage, la dégradation de l'ADN a été observée en l'absence de sucres ajoutés ou dans le galactose, mais pas dans le glucose, le maltose ou le saccharose. Fait intéressant, l'activité DNase a été observée chez le mutant ∆ccpA cultivé en présence ou en l'absence de l'un des sucres testés (Fig. 2 supplémentaire). Une souche génétiquement complétée, S. gordonii ccpAComp, a présenté un schéma similaire d'activité DNase au type sauvage. La suppression de malR n'a pas affecté l'activité de la DNase, ce qui suggère que ce répresseur n'est pas impliqué dans la régulation de l'expression de ssnA dans les conditions testées ici.

Pour quantifier l'étendue de l'inhibition du sucre sur l'activité SsnA, l'activité DNase des cellules cultivées dans du milieu BHY ou BHY additionné de différents sucres a été mesurée à l'aide d'un test basé sur la fluorescence (Fig. 4a). L'activité de la DNase de S. gordonii a été réduite de > 50 % en présence de glucose, de maltose, de galactose, de fructose ou d'inuline. Les streptocoques produisent de l'acide à partir des sucres et il est possible que l'activité de l'enzyme DNase ait été affectée par le pH des cultures. Le pH des surnageants des cultures de S. gordonii BHY en phase stationnaire était d'environ 5, 6, alors que le pH des cultures cultivées avec du galactose était d'environ 4, 6 (Fig. 4b). Le pH a encore été réduit entre 4 et 4,2 dans des cultures cultivées avec du glucose, du maltose, du fructose ou de l'inuline. Pour évaluer l'impact d'un pH bas sur l'activité de la DNase, BHY a été modifié à pH 5,5 par l'ajout de HCl et utilisé pour cultiver des cellules de S. gordonii en phase stationnaire. Le pH final après la croissance était d'environ 4,2 et presque aucune activité de DNase n'a été détectée dans les cellules cultivées dans du BHY acidifié (Fig. 4).

a Activité nucléase extracellulaire de S. gordonii DL1 cultivée dans BHY ou BHY + 2 % (p/v) de sucres : glucose (BHYG), maltose (BHYM), galactose (BHYGal), fructose (BHYF) ou inuline (BHYI). L'activité DNase extracellulaire des cellules de S. gordonii cultivées dans un milieu acidifié BHY/HCl (BHY amendé à pH 5,5 avec HCl) est représentée séparée par une ligne rouge. Les points de données sont affichés pour 3 répétitions indépendantes, les barres représentent la moyenne et SD est indiqué. b Le pH des cultures après croissance jusqu'à la phase stationnaire dans BHY, BHY + sucres ou dans BHY/HCl. c Les cultures d'une nuit de S. gordonii DL1 ont été récoltées et remises en suspension dans un tampon à pH 7,1 (ligne bleue), 5,5 (ligne rouge) ou 4,5 (ligne magenta). Après 2 h (flèche rouge), les cellules ont été récoltées et remises en suspension dans du PBS (pH 7,1) ou du PBS (pH 7,1) additionné de chloramphénicol (Chlm ; 12,5 μg/mL ; lignes vert clair et vert foncé). L'activité DNase est montrée pour la SsnA associée aux cellules. Les points de données sont affichés pour 3 répétitions indépendantes, les barres représentent la moyenne et SD est indiqué. Des mesures de densité optique (OD600 nm) ont été utilisées pour la normalisation dans chaque test.

Nous avons émis l'hypothèse que les effets d'un pH bas sur l'activité de SsnA n'étaient pas directement dus à l'inhibition enzymatique puisque le test a été effectué après lavage des cellules et remise en suspension dans du PBS à pH 7,1. Pour explorer plus avant la réduction de l'activité de SsnA médiée par le pH, S. gordonii DL1 a été incubé dans des tampons neutres ou acides et transféré à pH 7, 1 en présence ou en l'absence de chloramphénicol, un inhibiteur de la synthèse des protéines (Fig. 4c). L'activité totale de la DNase était plus faible dans les cellules incubées à pH 4,5 ou 5,5 que dans les cellules incubées à pH 7,1. Après un passage à pH 7,1, l'activité SsnA a augmenté dans les cellules qui avaient été incubées dans un tampon pH 4,5. La récupération de l'activité de SsnA était altérée en présence de chloramphénicol indiquant que la synthèse protéique de novo était nécessaire pour restaurer l'activité enzymatique. Dans les cellules qui avaient été incubées pendant 2 h à pH 5,5, l'activité de SsnA a légèrement augmenté, mais pas de manière significative, après un passage à pH 7,1. En présence de chloramphénicol, l'activité de SsnA a continué à diminuer après passage à pH 7,1 indiquant que l'enzyme active n'était pas restaurée.

Pour caractériser l'activité enzymatique plus en détail, SsnA a été purifié en tant que construction étiquetée GST. L'identité de la construction purifiée a été confirmée par empreinte de masse peptidique (Fig. 3 supplémentaire). Dans des expériences préliminaires, l'étiquette GST a été clivée avec de la thrombine et éliminée par purification par affinité. L'enzyme s'est avérée active avec ou sans l'étiquette GST (Fig. 4 supplémentaire). Étant donné que le retrait de l'étiquette a entraîné une perte significative de rendement de la protéine, nous avons utilisé la construction étiquetée GST pour les expériences ultérieures. Initialement, les effets du pH sur l'activité de la DNase ont été étudiés (Fig. 5a). Le pH optimal était compris entre 7 et 9,5. Aucune activité n'était détectable en dessous de pH 6,5 ou au-dessus de pH 10,5.

a L'activité nucléase de la SsnA purifiée a été quantifiée à un pH allant de 4,5 à 11. b En utilisant le dosage fluorescent quantitatif, l'activité DNase de la SsnA a été testée en présence d'une gamme de concentrations de Mn2+, Ca2+, Mg2+ et Zn2+. Les témoins négatifs sans enzyme sont indiqués. Dans tous les panneaux, les points ou les barres indiquent les moyennes de 3 expériences indépendantes et SE est indiqué.

Les nucléases dépendent fréquemment d'un cofacteur métallique divalent44. L'analyse par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) de SsnA n'a détecté aucun ion métallique associé à la protéine purifiée. Pour déterminer les cofacteurs métalliques préférés pour SsnA, l'activité enzymatique de SsnA a été testée en présence de Mn2+, Ca2+, Mg2+ ou Zn2+ (Fig. 5b). En l'absence de métaux ajoutés, aucune activité DNase n'a été détectée dans les préparations de SsnA. L'ajout de 10 µM de MnCl2, 20 µM de CaCl2, 40 µM de MgCl2 ou 40 µM de ZnSO4 a entraîné des niveaux élevés d'activité DNase. L'augmentation de la concentration de ZnSO4 à 80 µM a conduit à une inactivation presque complète de la DNase. L'activité DNase a également été abrogée à des concentrations élevées de MnCl2 (> 1,28 mM MnCl2).

Comme indiqué ci-dessus, les biofilms de S. mutans GS-5 étaient sensibles au traitement à la DNase I alors que les biofilms de S. gordonii ne l'étaient pas. Nous avons émis l'hypothèse que SsnA disperserait également les biofilms préformés de S. mutans. En utilisant la microscopie confocale à balayage laser, les biofilms de S. mutans ont été presque complètement éliminés par traitement avec SsnA (Fig. 6a). L'inhibition s'est avérée dépendante du pH dominant (Fig. 6b). À pH 4 ou 5, les biofilms n'ont pas été éliminés par SsnA. En revanche, les biofilms de S. mutans ont été réduits à <40 % de la biomasse témoin (sans traitement enzymatique) par la DNase I à pH 5. À pH 6, la DNase I et la SsnA ont été efficaces pour réduire les biofilms de S. mutans et la biomasse a été réduite. à <40 % des témoins. L'élimination du biofilm était encore plus importante à pH 7 et il ne restait que 10 à 20 % du biofilm après le traitement à la DNase I ou au SsnA. Sur la base de ces résultats, nous avons émis l'hypothèse que les cellules de type sauvage de S. gordonii, qui expriment SsnA, pourraient disperser les biofilms de S. mutans GS-5. Pour tester cette hypothèse, des biofilms préétablis de S. mutans cultivés pendant 20 h ont été traités avec des cellules de type sauvage ou ΔssnA de S. gordonii ou avec du milieu de culture usé (Fig. 5 supplémentaire). Le traitement avec des cellules de S. gordonii de type sauvage ou un surnageant de culture a considérablement réduit la biomasse du biofilm de S. mutans à environ 60 % du témoin. En revanche, le traitement avec des cellules S. gordonii ΔssnA n'a pas réduit les biofilms de S. mutans. Une réduction faible mais significative des biofilms de S. mutans a été observée après un traitement avec le surnageant de culture de S. gordonii ΔssnA (Fig. 5 supplémentaire). Dans l'ensemble, ces données montrent que SsnA favorise l'élimination des biofilms de S. mutans par S. gordonii.

a Microscopie confocale à balayage laser de biofilms préétablis de 20 h de S. mutans traités avec du PBS (contrôle) ou 5 µg/mL SsnA pendant 1 h à 37 °C. L'iodure de propidium (20 μM) a été utilisé pour visualiser les cellules. Les barres d'échelle sont de 30 µm (panneaux de gauche) ou 20 µm (panneaux de droite). b Biomasse de biofilms préétablis de S. mutans traités avec de la DNase I (5 µg/mL) ou du SsnA (5 µg/mL) à pH 4, 5, 6 et 7. Le dosage du cristal violet a été utilisé pour la quantification. Les points de données sont affichés pour 3 répétitions indépendantes, les barres représentent la moyenne et SD est indiqué.

Pour déterminer si SsnA peut contrôler le développement de biofilms oraux plus complexes, nous avons utilisé un système microfluidique BioFlux à double entrée pour développer des biofilms de microcosme oraux en présence ou en l'absence de SsnA sous le flux de salive naturelle comme seule source de nutriments. Le système a été inoculé avec de la salive non stérilisée pour ensemencer les canaux. Les biofilms ont été cultivés pendant 20 h et des images ont été prises toutes les 10 min (Fig. 7a; Film supplémentaire 1). Une nette inhibition du développement du microcosme buccal a été observée au cours des 20 h de croissance dans la moitié du canal dans lequel le SsnA était inclus. La coloration de l'ADN extracellulaire (eDNA) avec Yoyo-1 a montré que l'eDNA était également nettement réduit en présence de SsnA. Le signal de fluorescence a été quantifié au cours de la formation du biofilm (Fig. 7b). Une augmentation constante des niveaux d'ADNe a été observée sur 20 h de développement de biofilm dans la moitié supérieure du canal (contrôle) tandis que dans la moitié inférieure (supplémentée en SsnA), les niveaux d'ADNe sont restés stables tout au long de l'expérience.

a Visualisation des biofilms de microcosme oral développés dans le canal du système microfluidique à double entrée BioFlux avec de la salive contenant du SsnA (5 µg/mL) alimentant la moitié inférieure du canal. Les biofilms de microcosme ont été cultivés pendant 20 h. Yoyo-1 (2,4 nM) a été utilisé pour colorer l'ADNe dans le biofilm. b Quantification de l'accumulation d'ADNe pour la section contenant et sans SsnA du canal de croissance sur 20 h. Les images ont été prises toutes les 10 minutes et les quantités d'ADNe ont été déterminées à l'aide de GrayValue dans le logiciel FIJI. c Visualisation de biofilms de microcosme cultivés dans de la salive naturelle additionnée de 0,3 % de saccharose. SsnA (5 µg/mL) a été inclus dans le réservoir alimentant la moitié inférieure du canal. Yoyo-1 (2,4 nM) a été inclus pour la coloration de l'ADNe. d Quantification de l'accumulation d'ADNe pour la section contenant et sans SsnA du canal de croissance sur 20 h de croissance dans la salive additionnée de 0, 3% de saccharose. Les images ont été prises toutes les 10 minutes et les quantités d'ADNe ont été déterminées à l'aide de GrayValue dans le logiciel FIJI. Moyenne et SE de 3 répétitions indépendantes sont indiquées. Les barres d'échelle sont de 50 µm.

Des travaux antérieurs avaient montré que les sucres entraînaient une réduction du pH et une suppression de l'activité enzymatique SsnA (Fig. 4). Pour évaluer les effets du sucre sur le contrôle des biofilms du microcosme oral par SsnA, des biofilms ont été cultivés dans le système BioFlux dans de la salive additionnée de 0, 3% de saccharose (Fig. 7c; Film supplémentaire 2). Dans ces conditions, aucune réduction de l'accumulation de biofilm n'a été observée en présence de SsnA (Fig. 7c, d). Pour explorer davantage l'impact du saccharose sur l'ADNe dans les biofilms de microcosmes oraux, la nucléase extracellulaire NucB de Bacillus licheniformis a été utilisée car il a déjà été démontré qu'elle contrôlait le développement de biofilms de microcosmes oraux dans des conditions statiques31. En présence de NucB, le développement du biofilm dans la salive était fortement inhibé par rapport aux témoins (Fig. 8a, b; Film supplémentaire 3). Une inhibition similaire a été observée dans des cultures cultivées dans de la salive additionnée de 0, 3% de saccharose (Fig. 8c, d; Film supplémentaire 4). Prises ensemble, les données ci-dessus indiquent que l'ADNe est important pour le développement de biofilms de microcosmes oraux et que le SsnA n'est pas efficace pour contrôler l'accumulation de biofilm dépendant de l'ADNe en présence de saccharose.

a Biofilms de microcosmes oraux cultivés pendant 20 h dans de la salive naturelle et additionnés de NucB dans la partie inférieure du canal microfluidique. Le colorant Yoyo-1 (2,4 nM) a été utilisé pour la visualisation de l'ADNe. b eDNA quantifié dans les deux moitiés du canal de croissance sur 20 h de croissance. L'eDNA a été mesuré par la détermination de GrayValue dans le logiciel FIJI pour des images prises toutes les 10 minutes. c De la salive additionnée de saccharose (0,3 %) a été utilisée pour faire croître des biofilms de microcosme et NucB a été inclus dans la moitié inférieure du canal de croissance. d ADNe quantifié pour les moitiés contenant NucB et sans NucB du canal de croissance sur 20 h de croissance dans du saccharose (0, 3%) contenant de la salive. Moyenne et SE de 3 répétitions indépendantes sont indiquées. Les barres d'échelle sont de 50 µm.

Ici, nous avons identifié et caractérisé SsnA, une enzyme DNase associée à la paroi cellulaire extracellulaire produite par S. gordonii. Les enzymes DNase extracellulaires sont largement produites par des espèces pathogènes de streptocoques et sont d'importants facteurs de virulence39,45,46,47. Un certain nombre de streptocoques commensaux oraux, y compris S. sanguinis, Streptococcus intermedius, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguinis et Streptococcus mitis produisent des niveaux détectables d'activité de DNase extracellulaire34,41. Parmi celles-ci, seule la DNase extracellulaire de S. sanguinis a été caractérisée. Cette enzyme, appelée SWAN (Streptococcal Wall-Anchored Nuclease), s'est avérée médiatrice de l'échappement des pièges extracellulaires de neutrophiles (NET)41. Il existe des preuves que S. mutans peut également s'échapper des TNE en utilisant une désoxyribose aldolase DeoC48. Cependant, la production de nucléase extracellulaire par S. mutans est faible ou indétectable dans les tests d'activité DNase34. Nos données ont identifié un rôle pour S. gordonii SsnA dans la modulation de la formation de biofilm par des espèces concurrentes telles que S. mutans. En outre, il a été démontré que la capacité de SsnA à médier la compétition interspécifique dans les biofilms dépend du pH et de la concentration de sucres en vigueur. Par conséquent, il semble que les DNases extracellulaires streptococciques puissent jouer un rôle important dans le maintien de la stabilité des biofilms de la plaque dentaire.

SsnA a été identifié en recherchant dans le génome de S. gordonii des gènes codant pour des protéines avec des domaines de type DNase I. La famille des DNase I comprend une gamme variée de nucléases et de phosphatases qui partagent un repli protéique conservé49. Bien que notre analyse suggère que la majorité de SsnA est liée aux cellules, une étude par spectrométrie de masse de l'ensemble du sécrétome de S. gordonii a révélé la présence de SsnA (SGO_1651) parmi 107 protéines sécrétées50. Par conséquent, il est probable qu'une partie de l'enzyme soit libérée de la surface cellulaire. Des homologues de S. gordonii SsnA sont présents dans un large éventail de streptocoques oraux, notamment S. sanguinis, S. intermedius, S. constellatus, S. anginosus et S. parasanguinis (Fig. 6 supplémentaire), ce qui indique que l'enzyme joue probablement des rôles importants. dans les biofilms buccaux. De plus, des homologues plus éloignés sont présents dans les streptocoques pathogènes, notamment S. pyogenes et les importants agents pathogènes animaux S. suis, S. equi et S. iniae (Fig. 6 supplémentaire).

L'activité SsnA est fortement réduite en présence de sucres. La supplémentation en glucose ou en disaccharides contenant du glucose a conduit à une inhibition complète de l'activité de la DNase extracellulaire. En amont du gène ssnA se trouve un motif de séquence CRE et la régulation a été abrogée chez un mutant ΔccpA. Par conséquent, il est probable que CcpA agisse au niveau de la régulation génique pour contrôler l'expression de ssnA en présence de glucose. Malheureusement, le mutant ΔccpA s'est développé lentement dans des cultures en bouillon et nous n'avons pas pu obtenir de données reproductibles à partir de l'analyse RT-qPCR de l'expression de ssnA dans cette souche. La régulation des enzymes DNase extracellulaires par CcpA a été observée chez d'autres espèces de streptocoques, notamment S. suis et S. pyogenes51,52. Chez S. gordonii, la CCR est induite par une large gamme de sucres et nous n'avons pas été en mesure d'identifier un sucre qui ne conduit pas à la CCR chez S. gordonii43. En fait, certains sucres tels que le galactose et le lactose provoquent des réponses régulatrices complexes chez S. gordonii qui impliquent plusieurs régulateurs en plus de CcpA53. Il est intéressant de noter que le galactose n'a pas réduit l'activité de SsnA dans un essai sur plaque de gélose (Fig. 2 supplémentaire), alors qu'il a fortement réprimé SsnA dans les cultures en bouillon (Fig. 3). Nous émettons l'hypothèse que cela peut être dû à des voies de régulation qui compensent la répression de l'expression de ssnA médiée par CcpA induite par le galactose sur des cultures sur plaque de gélose. Des travaux supplémentaires seront nécessaires pour identifier les voies de régulation qui contrôlent l'expression de ssnA dans les biofilms.

L'activité de SsnA peut également avoir été affectée par le pH dans le milieu de croissance. Le métabolisme des sucres a conduit à une acidification du milieu de croissance à pH < 5,0. L'incubation des cellules à un pH tout aussi bas a entraîné une perte rapide de l'activité de la DNase extracellulaire qui n'a été restaurée que par la synthèse protéique de novo. Les enzymes DNase I de mammifère ont tendance à avoir un pH optimal relativement bas, autour de 6,5 à 7, alors que d'autres membres de la famille DNase I montrent une préférence pour des conditions de pH plus élevées54. La plage d'activité de pH de la SsnA recombinante (6,5 à 10,5) semble être légèrement supérieure à celle de l'homologue S. sanguinis SWAN, qui est actif de pH 5,5 à 9,0, avec une activité maximale à pH 41 approximativement neutre. L'incubation de SsnA recombinant dans des conditions de pH bas n'a pas entraîné d'inactivation irréversible de l'enzyme et l'activité a été entièrement restaurée lorsque l'enzyme a été remplacée par un tampon à pH plus élevé (Fig. 7 supplémentaire). Par conséquent, il semble que l'inactivation de la SsnA liée à la paroi cellulaire après la croissance dans des sucres ou un milieu à faible pH est principalement due au renouvellement des protéines plutôt qu'à l'inhibition directe de l'enzyme. Néanmoins, il convient de noter que le chloramphénicol entraînera l'arrêt général de la synthèse des protéines, ce qui pourrait avoir un impact indirect sur l'activité de SsnA, par exemple en influençant le pH dans les cellules et dans l'environnement immédiat.

En plus du pH, les ions métalliques sont importants pour l'activité des enzymes de la famille DNase I. Par exemple, l'activité de S. sanguinis SWAN est renforcée par Mg2+ et Ca2+41. De même, nous avons constaté que Mg2+ ou Ca2+ favorisaient l'activité de SsnA. Cela suggère que SsnA peut utiliser l'un ou l'autre de ces métaux, plutôt que de nécessiter les deux comme SWAN ou certaines autres enzymes de la famille DNase I. À de faibles concentrations, Mn2+ et Zn2+ semblaient également activer SsnA. Cependant, l'activité a nettement diminué à > 64 μM Mn2+ ou > 40 μM Zn2+. De faibles concentrations (40 μM) de l'agent chélateur EDTA ont été incluses dans ces expériences pour éliminer les métaux traces associés à l'enzyme ou au substrat d'ADN. Il est possible que le Zn2+ ait déplacé le Mg2+ ou le Ca2+ de l'EDTA, activant indirectement l'enzyme. À des concentrations plus élevées, Zn2+ en particulier semble être un puissant inhibiteur de SsnA. Ceci est cohérent avec d'autres enzymes de la famille DNase I, y compris la DNase I humaine, qui sont inhibées par Zn2+55. D'autre part, nous supposons que la diminution de l'activité à des concentrations plus élevées de Mn2+ peut être causée par une liaison significative de Mn2+ au substrat d'ADN, interférant avec la reconnaissance/l'interaction de l'enzyme. Les concentrations de Zn2+ dans la salive sont de l'ordre de 0,2 à 1,2 μM, alors que Ca2+ est présent à environ 0,5 à 2,75 mM et Mg2+ à 7 à 30 μM56. Ces concentrations soutiendraient potentiellement l'activité de SsnA dans les biofilms oraux.

Le rôle des enzymes DNase extracellulaires dans la médiation des interactions interspécifiques dans les biofilms streptococciques n'a pas été étudié auparavant. Ici, nous avons montré que les biofilms formés par S. mutans GS-5 dépendent de l'ADNe pour leur stabilité. Lorsqu'il est cultivé avec l'enzyme NucB DNase, S. mutans NG8 a produit environ 20 % de la biomasse du biofilm par rapport au témoin (NucB absent), alors que S. mutans UA159 n'a été réduit qu'à environ 80 % de la biomasse témoin (Fig. 8 supplémentaire). un niveau cohérent avec d'autres travaux publiés24. La raison pour laquelle certaines souches sont plus dépendantes de l'eDNA que d'autres n'est pas claire, bien que ce phénomène ait également été observé pour d'autres streptocoques oraux57. Il convient de noter que certaines cultures de laboratoire de S. mutans GS-5, y compris la nôtre, portent des mutations des gènes pac et gbpC, qui conduisent à la sécrétion de la protéine de surface cellulaire PAc (antigène I/II) et à une absence de production de GbpC (protéine C de liaison au glucane)58. Des études futures sont nécessaires pour déterminer si PAc et/ou GbpC affectent la dépendance des biofilms de S. mutans à l'ADNe.

La capacité de SsnA à disperser les biofilms statiques de S. mutans GS-5 dépendait du pH du milieu. À pH 5,0, SsnA ne dispersait pas les biofilms contrairement à la DNase I, qui conservait une activité anti-biofilm. Fait intéressant, à pH 6,0, SsnA et DNase I ont réduit les biofilms à environ 40 % des niveaux des témoins, indiquant que les deux enzymes étaient actives dans ces conditions. En revanche, le SsnA recombinant n'était pas actif en dessous de pH 6,5 lorsqu'il était testé contre une sonde oligonucléotidique fluorescente. Il est possible que l'environnement à l'intérieur des biofilms tamponne le faible pH59. Alternativement, cela pourrait être dû à des différences dans la nature du substrat d'ADN. La capacité de SsnA à contrôler les biofilms de S. mutans à environ pH 6,0 peut être importante dans les conditions de la cavité buccale, car il a été démontré que les biofilms de S. mutans contiennent moins de glucane et dépendent davantage de l'ADNe lorsqu'ils sont cultivés à pH 6,0 que lorsqu'ils sont cultivés. à pH 7,060. Néanmoins, la réduction du pH à 5,0 ou moins peut représenter une stratégie défensive de S. mutans contre SsnA. Il convient de noter que la disponibilité du saccharose et de l'amidon stimule davantage la libération d'ADNe et la production d'acide par S. mutans, conduisant à l'établissement d'un biofilm stable25. De manière constante, la croissance de S. mutans dans les biofilms d'espèces mixtes qui contiennent également le biofilm de S. gordonii est améliorée en présence de saccharose61,62.

La présence de SsnA a inhibé la croissance de biofilms de microcosmes oraux d'espèces mixtes sous flux de salive humaine naturelle, ce qui suggère que l'activité anti-biofilm de SsnA n'est pas spécifique aux biofilms de S. mutans. En plus de S. mutans, les biofilms d'une seule espèce de plusieurs micro-organismes oraux tels que S. intermedius et S. sanguinis se sont révélés sensibles au traitement avec des enzymes DNase63,64,65. Étant donné que le développement du biofilm oral est fortement affecté par les interactions interspécifiques cellule-cellule66, nous supposons que l'exclusion de certaines espèces pourrait avoir des effets dramatiques sur l'accumulation de plaque dentaire. Les effets délétères du SsnA sur les biofilms oraux d'espèces mixtes sont cohérents avec les résultats obtenus à partir du traitement de la plaque dentaire in situ cultivée avec la DNase I32. Auparavant, nous avons montré que la présence de NucB DNase au cours du développement du microcosme buccal entraînait une réduction de la biomasse67. Curieusement, la diversité microbienne dans les biofilms oraux a également été affectée. Le biofilm développé en présence de NucB contenait des proportions réduites d'espèces de colonisateurs tardifs anaérobies et protéolytiques telles que Peptostreptococcus, Porphyromonas et Prevotella31. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si SsnA inhibe sélectivement certaines espèces dans le biofilm.

Sur la base de nos découvertes, nous supposons qu'il pourrait être possible de cibler l'expression de DNases streptococciques telles que SsnA pour contrôler la croissance de la plaque dentaire. Cependant, l'inhibition de SsnA par un pH bas peut limiter le développement de cette stratégie contre les biofilms cariogènes. Nous notons que SsnA n'a pas été efficace pour contrôler la croissance du biofilm dans la salive supplémentée en saccharose, probablement en raison de la production d'acide par des micro-organismes dans le biofilm. La production de glucanes qui peuvent interagir avec l'ADN et stabiliser la matrice68 peut également avoir contribué au manque d'activité de SsnA dans ces conditions. D'autres études visant à comprendre les mécanismes de régulation régissant la production et l'activité de SsnA, et les effets des DNases extracellulaires microbiennes orales sur la structure et la composition microbienne de la plaque dentaire, pourraient conduire au développement de nouvelles approches pour contrôler les biofilms multi-espèces en ciblant la matrice extracellulaire. .

Streptococcus gordonii DL1 (Challis), Staphylococcus aureus FH7 et Streptococcus mutans GS-5 (tableau supplémentaire 1) ont été cultivés en routine dans du milieu BHY (Brain Heart Infusion 37 g/L et 5 g/L d'extrait de levure) à 37 °C en anaérobiose (10 % CO2, 10 % H2 et 80 % N2 dans une Ruskinn BugBox Plus, Ruskinn Technology Ltd, Bridgend, Royaume-Uni). La gélose BHY (milieu BHY plus 15 g/L Bacto-agar) a été utilisée comme milieu solide. Lorsque nécessaire, des antibiotiques ont été inclus comme suit : kanamycine (250 μg/mL), spectinomycine (250 μg/mL) et érythromycine (10 μg/mL pour les insertions chromosomiques et 2 μg/mL pour les plasmides). Escherichia coli a été cultivé dans un bouillon de lysogénie (Melford Laboratories, Ipswich, Royaume-Uni) à 37 ° C avec agitation à 200 tr/min.

L'ADN intracellulaire (iDNA) ou l'ADN extracellulaire (eDNA) a été extrait comme décrit par Kreth et al.21. S. gordonii ou S. mutans ont été cultivés pendant une nuit dans un milieu TYEG contenant 10 g de Bacto tryptone, 5 g d'extrait de levure, 3 g de K2HPO4 et 2 g de glucose par L, ajusté à pH 7,5. Un total de 10 µL a été transféré dans 2 mL de TYEG frais dans les puits d'une boîte en plastique à 12 puits et les cultures ont été incubées avec une légère oscillation (20 tr/min) pendant 72 h avec des changements de milieu après chaque 24 h. Le surnageant a été aspiré et les puits ont été lavés deux fois avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4. Après avoir aspiré le liquide, 1,5 ml de PBS supplémentaire a été ajouté à un puits et le biofilm a été récolté par grattage doux avec un grattoir pour culture tissulaire. Pour fournir une biomasse suffisante pour l'extraction de l'ADN, cet échantillon a été transféré dans un puits équivalent et un biofilm supplémentaire a été gratté. Au total, les biofilms de quatre puits ont été combinés pour chaque échantillon. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 12 000 g, 4 ° C, 30 min et le surnageant (échantillon d'ADNe) et le culot (contenant des cellules avec ADNi) ont été stockés à -20 ° C jusqu'à purification supplémentaire.

Pour la purification de l'eDNA, un volume égal de 25:24:1 phénol:chloroforme:alcool isoamylique a été ajouté et mélangé par inversion 30 à 40 fois. Après centrifugation à 16 000 g, 4 °C pendant 5 min, la phase aqueuse a été recueillie et l'extraction phénol : chloroforme : alcool isoamylique a été répétée. Après une nouvelle centrifugation, la phase aqueuse a été recueillie et l'ADN a été précipité en ajoutant un dixième de volume d'acétate de sodium 3 M, pH 5,2 et en mélangeant. Les deux tiers du volume d'isopropanol ont été ajoutés et mélangés, et l'ADNe a été sédimenté par centrifugation à 16 000 g, 4 ° C pendant 10 min. Après lavage avec 1 ml d'éthanol à 100 %, le culot a été séché à l'air et remis en suspension dans 20 ul de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0.

Pour extraire l'ADNi, les culots cellulaires ont été remis en suspension dans 150 µL de tampon de sphéroplastie (Tris-HCl 20 mM, MgCl2 10 mM et raffinose 26 % (p/v), ajusté à pH 6,8). À cela, 1,5 µL de lysozyme d'un stock de 250 µg mL-1 et 5 µL de mutanolysine d'un stock de 10 000 U mL-1 ont été ajoutés et les échantillons ont été incubés pendant 30 min à 37 °C. Les cellules ont été lysées par addition de 150 µL de solution de lyse T&C contenant 1 µL de protéinase K (kit de purification d'ADN Epicentre MasterPure, Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) et l'ADN a été extrait en suivant les instructions du fabricant.

Pour identifier les homologues potentiels de la famille DNase I chez S. gordonii, la superfamille du domaine DNase I a été identifiée dans la base de données Superfamily (https://supfam.mrc-lmb.cam.ac.uk/SUPERFAMILY/cgi-bin/scop.cgi? sunid=56219). Les membres de la famille de la DNase I de S. gordonii ont été identifiés sous « attributions de génomes ». Le gène ssnA et la région promotrice ont été extraits du génome de S. gordonii Challis (accession GenBank CP000725.1). Les sites de liaison putatifs du facteur de transcription ont été identifiés à l'aide de PePPER69.

Les bactéries ont été inoculées dans 200 μL de milieu en triple exemplaire dans des plaques à 96 puits en polystyrène. Les plaques ont été incubées en anaérobiose à 37 °C pendant 20 h. Lors de la réalisation d'essais d'inhibition de biofilm, la DNase bovine I ou GST-SsnA (5 µg/mL) a été incluse au point d'inoculation. Pour les essais de dispersion, des enzymes (5 µg/mL) ont été ajoutées à des biofilms vieux de 20 h et incubées pendant une heure supplémentaire à 37 °C. L'étendue du biofilm a été quantifiée à l'aide du test au cristal violet57. Les tests de biofilm ont été répétés trois fois indépendamment. La signification des différences entre les lectures d'absorbance a été déterminée par le test t de Student à deux échantillons.

Une sonde oligonucléotidique, 5′ HEX-CCC CGG ATC CAC CCC- BHQ2 3′ (sonde PrimeTime Integrated DNA Technologies), a été utilisée pour la quantification de l'activité DNase comme décrit par Kiedrowski et al.70. La sonde (2 μM de la sonde dans un tampon constitué de 20 mM Tris-HCl pH 8) a été ajoutée à 25 μL d'une source de nucléase (cellules ou enzyme purifiée) dans un puits d'une plaque de microtitration 384 puits (Greiner Bio- One, Stonehouse, UK) et le taux de changement de fluorescence (λex : 530 nm, λem : 590 nm) a été mesuré à 37 °C pendant 30 min à l'aide du lecteur de microplaques Synergy HT (BioTek, Swindon, UK).

La perturbation du ssnA a été réalisée en remplaçant le ssnA chromosomique par le déterminant de résistance à la spectinomycine aad9. Les régions flanquantes du gène ssnA ont été amplifiées par PCR à l'aide des amorces SsnAF1 et SsnAR1 pour générer un produit de 484 pb dans la région 5 'de ssnA et SsnAF2 et SsnAR2 pour générer un produit de 674 pb à l'extrémité 3' de ssnA. Le gène aad9 (782 pb) a été amplifié à partir du plasmide pFW5 (tableau supplémentaire 1) avec les amorces aad9_SsnAF et aad9_SsnAR. Ces réactions PCR ont été réalisées avec Taq Reddymix (Sigma Aldrich, Gillingham, UK) et des conditions de cyclage de 94 °C, 2 min, 35 cycles de 94 °C pendant 10 s, 56 °C pendant 30 s, 68 °C pendant 90 s , puis 68 ° C pendant 7 min et maintien à 4 ° C. Les produits de PCR ont été mélangés dans des rapports équimolaires et amplifiés dans une PCR d'extension de chevauchement en utilisant les amorces SsnAF1 et SsnAR2 avec le mélange d'enzymes Expand Long Range PCR (Sigma Aldrich). Le thermocyclage a été effectué comme suit : 92 °C, 2 min, 10 cycles de 92 °C, 10 s, 56 °C, 15 s, 68 °C 150 s, 25 cycles de 92 °C, 10 s, 56 °C, 15 s, 68 °C 150 s et en augmentant de 20 s par cycle, puis 68 °C pendant 7 min et maintien à 4 °C. Le produit résultant a été utilisé pour la transformation de S. gordonii DL1. Pour cela, S. gordonii a été cultivé en pot à bougie jusqu'au début de la phase exponentielle (DO600 nm ~ 0,3) dans du milieu BHY additionné de 1 µL mL-1 de sérum de veau fœtal et de 0,1 % (p/v) de glucose (BHY/FCS/G ). Après 60 minutes supplémentaires à 37 °C, les cultures ont été réparties en aliquotes de 0,8 ml et environ 1 µg du produit de PCR a été ajouté. Après une incubation supplémentaire de 4 h, les cultures ont été diluées et cultivées sur du milieu BHY solidifié pendant 36 h dans un pot à bougie. La perturbation et le remplacement réussis du gène ssnA par le gène aad9 ont été confirmés par séquençage de l'ADN.

La perturbation de ccpA a été réalisée en utilisant une approche similaire en remplaçant ccpA par le gène de résistance à la kanamycine kanR. La région en amont de ccpA a été amplifiée avec CcpAF1 et CcpAR1 générant un fragment de 520 pb et la région en aval de ccpA a été amplifiée en utilisant CcpAF2 et CcpAR2. Le gène kanR a été amplifié avec les amorces KanR_F et KanR_R en utilisant le vecteur pK18 (tableau supplémentaire 1) comme matrice. Gibson Assembly Master Mix (New England BioLabs, Ipswich, Massachusetts, États-Unis) a été utilisé pour la fusion des fragments en amont et en aval de ccpA au gène kanR conformément aux instructions du fabricant. Le fragment de 1 795 pb résultant a été utilisé pour la transformation de cellules de S. gordonii. La rupture et le remplacement réussis du gène ccpA par le gène kanR ont été confirmés par séquençage de l'ADN.

La mutagenèse du gène malR a été obtenue en remplaçant malR par la cassette de résistance à l'érythromycine ermAM. En utilisant les amorces malRF1 et malRR1, un fragment de 471 pb en amont du gène malR a été amplifié. malRF2 et malRR2 ont été utilisés pour amplifier une séquence de 421 pb en aval du gène malR. Les amorces malRR1 et malRF2 contenaient des séquences complémentaires de 17 pb pour les amorces ermAMF2 et ermAMR2. Après amplification de la cassette ermAM à partir de pVA838 (tableau supplémentaire 1), les produits de PCR ont été cousus ensemble dans une PCR d'extension de chevauchement. Le produit résultant a été utilisé pour la transformation de S. gordonii DL1.

Pour la complémentation génique, le plasmide pssnAComp a été créé par amplification de ssnA à l'aide des amorces SsnA.compF et SsnA.compR et de l'ADN génomique de S. gordonii DL1 de type sauvage comme matrice. Les amorces SsnA.compF et SsnA.compR comprenaient respectivement les sites d'enzymes de restriction EcoRI et BamHI. L'amplicon a été digéré avec BamHI et EcoRI et ligaturé dans le vecteur pDL276 (tableau supplémentaire 1) qui avait également été digéré avec BamHI et EcoRI (New England BioLabs). La construction réussie de pssnAComp a été confirmée par séquençage et a été utilisée pour transformer le mutant S. gordonii ΔssnA afin de générer la souche génétiquement complétée S. gordonii ssnAComp.

Le plasmide pccpAComp a été généré en remplaçant le gène arcR dans parcRComp71 par le gène ccpA. Les amorces CcpA_compF et CcpA_compR ont été utilisées pour amplifier le gène ccpA en utilisant l'ADN génomique de S. gordonii de type sauvage comme matrice, générant un fragment de 1048 pb. Les amorces Lin-vecF et Lin-vecR ont été utilisées pour créer un vecteur linéarisé en utilisant le plasmide parcRComp comme matrice, produisant un vecteur linéaire de 5797 pb. Le kit de clonage de ligature PCR In-Fusion HD (Clontech Laboratories, Mountain View, Californie, États-Unis) a été utilisé pour fusionner le fragment ccpA au squelette du vecteur générant pccpAComp. L'intégrité du plasmide pccpAComp a été confirmée par séquençage et pccpAComp a été utilisé pour la transformation de S. gordonii ΔccpA pour générer S. gordonii ccpAComp.

Des manipulations génétiques de routine ont été effectuées à l'aide de protocoles décrits par Sambrook et al.72 et expliqués ci-dessous. Les plasmides et les amorces sont décrits dans le tableau supplémentaire 1 et le tableau supplémentaire 2.

SsnA a été cloné en tant que construction de fusion glutathion S-transférase (GST). L'étiquette GST a été clivée si nécessaire. Le gène ssnA, moins le motif d'ancrage cellulaire LPxTG C-terminal et le domaine de signal de sécrétion N-terminal, a été amplifié à l'aide des amorces ssnA_Pf7 et ssnA_Pr7, créant un produit de 2150 pb. Ce produit a été cloné dans le plasmide pGEX-KT (tableau supplémentaire 1) et transformé dans E. coli DH5α. Pour la transformation, des cellules d'E. coli chimiquement compétentes ont été produites en cultivant E. coli en phase exponentielle précoce (OD600 nm ~ 0,3) dans 50 ml de LB, en récoltant pendant 5 min à 5000 tr/min et en suspendant le culot dans 20 ml de CaCl2 50 mM glacé. . Après repos dans la glace pendant 20 min, les cellules ont été récoltées par centrifugation à 5000 tr/min, 4 ° C pendant 5 min et mises en suspension dans 4 ml de CaCl2 glacé. Les échantillons ont été répartis en portions de 300 µL, l'ADN a été ajouté et incubé sur de la glace pendant 40 min. Les cellules ont été soumises à un choc thermique à 42 °C pendant 2 minutes et plongées dans de la glace. Les transformants ont été récupérés en ajoutant 500 µL de milieu SOC préchauffé contenant 20 g L-1 Bacto tryptone, 5 g L-1 extrait de levure, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 et 20 mM glucose, et incuber pendant 1 h à 37 ° C, 250 tr/min avant de se répandre sur des plaques de gélose LB sélectives. Le plasmide pGEX-ssnA a ensuite été transféré sur E. coli BL21 (DE3) pLysS (Stratagene, La Jolla, Californie, USA). L'expression de GST-SsnA a été induite par 1 mM d'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (Sigma Aldrich) pendant 4 h à 37 ° C. Une colonne de glutathion Sepharose a été utilisée pour éluer GST-SsnA dans 10 mM de glutathion, 50 mM de phosphate de potassium, pH 7,2, 1 mM de DTT (Sigma Aldrich). Une coloration et une zymographie au SDS-PAGE et au bleu brillant de Coomassie ont été réalisées pour évaluer la taille et l'activité de la GST-SsnA purifiée.

L'étiquette de protéine GST de 26 kDa N-terminale a été clivée par la thrombine. Le SsnA purifié a été échangé du tampon d'élution au tampon TNC (Tris-HCl 20 mM [pH 7,5], NaCl 50 mM et CaCl2 1 mM) pour un clivage optimal de l'étiquette GST. Les échantillons ont été incubés pendant 24 h à température ambiante avec 1 U de thrombine bovine (Sigma) pour chaque 0,025 mg de SsnA. La thrombine a été inactivée par l'ajout de 0,3 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et incubée à 37°C, 15 min.

Pour la croissance du biofilm du microcosme d'espèces mixtes, la salive a été prélevée sur des volontaires sains qui n'avaient ni mangé ni bu (sauf de l'eau) au cours de la dernière heure et n'avaient pas pris d'antibiotiques au cours des 3 dernières semaines. L'approbation éthique pour la collecte de salive a été accordée par le comité d'éthique de la faculté des sciences médicales de l'Université de Newcastle (réf. 1853/519/2020). Au besoin, la salive a été traitée avec du dithiothréitol, les précipités ont été éliminés par centrifugation et la salive a été stérilisée par filtration pour créer de la salive acellulaire (CFS)73. Le BioFlux 1000 (Fluxion, San Francisco, CA) a été utilisé pour cultiver des biofilms de microcosmes oraux d'espèces mixtes. Avant l'inoculation, les canaux des plaques à 24 puits à double flux BioFlux (Fluxion) ont été amorcés par l'ajout de 200 μL de salive acellulaire (CFS) et une incubation à température ambiante pendant 20 min. L'excès de CFS a ensuite été retiré du puits de sortie et remplacé par 100 μL de salive non traitée. Le flux a été initié de la sortie à l'entrée à 1,0 dyn/cm2 pendant 6 s. La plaque a ensuite été incubée à 37°C pendant 40 min pour permettre l'ensemencement. Chacun des puits d'entrée a ensuite été rempli de CFS préchauffé (à 37 ° C) et le débit a été lancé à 0, 5 dyn / cm2 à 37 ° C pendant 18 h et des images ont été prises toutes les 10 min. Si nécessaire, le CFS dans les puits d'entrée a été complété avec 2 % de saccharose ou d'enzymes DNase. Les enzymes DNase utilisées étaient la DNase bovine I (Sigma Aldrich), Bacillus licheniformis NucB67 et S. gordonii SsnA. Ils ont été ajoutés aux entrées à une concentration de 5 µM. Pour visualiser l'eDNA, 2,4 nM de colorant Yoyo-1 (LifeTechnologies) a été inclus avec le CFS dans les deux puits d'entrée.

L'imagerie des biofilms cultivés dans le BioFlux 1000 a été réalisée à l'aide du poste de travail d'imagerie BioFlux 1000Z composé d'un microscope Zeiss Axio Observer Z1 équipé d'une enceinte environnementale. Une caméra Hamamatsu (ORCA-Flash 4.0 LT : 4,2 mégapixels avec des pixels de 6,5 microns) et le logiciel de montage BioFlux (Fluxion) ont été utilisés pour l'acquisition des images. Les images ont été analysées à l'aide d'ImageJ v.1.48 (National Institutes of Health)74.

Les images accélérées de chaque canal ont été converties en une pile. Chaque pile a été auto-seuillée à l'aide de l'algorithme 'Otsu'. Un rectangle de w = 1000 h = 200 pixels (taille de l'image stock 1024 × 1024 pixels) a été sélectionné et enregistré en tant que région d'intérêt (ROI). L'intensité moyenne des pixels (valeur de gris moyenne) a été mesurée pour chaque tranche et tracée à l'aide du logiciel SigmaPlot 13.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA).

Pour la visualisation des biofilms statiques avec la microscopie confocale à balayage laser (CLSM), les lamelles colorées ont été rincées avec du PBS et inversées sur un cadre en caoutchouc rempli de PBS fixé sur une lame de microscope. L'imagerie a été réalisée à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser Nikon A1R équipé d'un objectif CFI PLAN APO VC (Nikon 60x/1.40 Oil). Les images ont été capturées avec le logiciel NIS-Elements C (v4.4, Nikon) et traitées à l'aide du logiciel Imaris (v8.2, Bitplane).

L'activité DNase extracellulaire de S. gordonii a été évaluée à l'aide d'une gélose de test DNase (Sigma Aldrich, Gillingham, Royaume-Uni). Les cultures bactériennes ont été striées ou tachetées (10 µL) sur de la DNase Test agar et incubées en aérobiose pendant 48 h à 37 °C. L'ADN dans la DNase Test agar a été précipité en inondant la plaque avec 1 N HCl.

Pour déterminer l'activité nucléase des cultures bactériennes, les cultures d'une nuit ont été lavées deux fois avec du PBS à pH 7,1 et remises en suspension dans du PBS à une densité optique, OD600 nm = 1. L'activité DNase a ensuite été mesurée pour 25 µL de la suspension cellulaire à l'aide du Synergy HT lecteur de microplaques (BioTek). Pour des expériences visant à tester la récupération de l'activité de la DNase après une incubation à faible pH, des cultures d'une nuit de cellules S. gordonii DL1 cultivées dans du milieu THYE à 37 °C ont été récoltées et remises en suspension dans un tampon à pH 4,5 (77,1 g/L d'acétate d'ammonium, 70 mL/L d'acide acétique glacial), un tampon pH 5,5 (96,3 mL de solution I [13,61 g/L KH2PO4 (BDH)] et 3,6 mL de solution II [35,81 g/L Na2HPO4]) et du PBS (pH 7,1). Les cellules ont été incubées à température ambiante pendant jusqu'à 2 h, lavées dans du PBS, remises en suspension dans du PBS frais et des aliquotes de 25 µL ont été testées pour l'activité DNase à l'aide du test d'activité DNase basé sur la fluorescence. Après 2 h, les cellules ont été récoltées et lavées dans du PBS à pH 7,1. Les cultures qui avaient été incubées dans des tampons acides (pH 4,5 ou 5,5) ont été divisées en portions égales avant la récolte. Une portion a été remise en suspension dans du PBS tandis que l'autre a été remise en suspension dans du PBS contenant 12,5 µg/mL de chloramphénicol pour inhiber la synthèse de novo des protéines75. Les cultures ont été incubées jusqu'à 2 heures supplémentaires avant que l'activité de la DNase ne soit mesurée.

Lors de l'étude de l'activité de SsnA purifié en présence de métaux, 40 µM d'EDTA ont été inclus dans les réactions pour chélater les contaminants métalliques résiduels du tampon ou associés au substrat d'ADN avant l'ajout du cofacteur métallique putatif. Lorsque ce test a été utilisé pour déterminer le pH optimal pour l'activité enzymatique SsnA, les tampons suivants ont été utilisés : tampon d'acétate de sodium trihydraté (pH 4,5-5,5), Bis-Tris (pH 6,0-6,5), Tris-HCl (pH 7,0-9,0 ) et tampon acide 3-cyclohexylamino-1-propanesulfonique (pH 9,7-11,0) (Sigma Aldrich).

La zymographie a été utilisée pour évaluer l'activité de SsnA purifié avec ou sans l'étiquette GST contre l'ADN double brin. Les enzymes dans le tampon de Laemmli ont été chargées (sans ébullition) sur des gels SDS-PAGE à 12 % contenant 100 μg/mL d'ADN de sperme de saumon (Sigma Aldrich). Suite à l'électrophorèse, le gel a été incubé dans un tampon de réactivation enzymatique (Tris-HCl 40 mM, CaCl2 5 mM, MgCl2 5 mM et lait en poudre délipidé 3% [Premier International Foods, St. Albans, UK]) pendant 20 h à 37° C Le gel a été coloré avec du bromure d'éthidium (0,5 μg mL-1) pendant 30 min et lavé 3 fois pendant 15 min chacun, dans de l'eau distillée. Le gel a été visualisé sous lumière ultraviolette à l'aide du transilluminateur G:BOX (Syngene).

Quatre ml de culture cellulaire ont été mélangés avec 4 ml d'ARNlater (Life Technologies), et les tubes ont été mélangés au vortex pendant 5 s et incubés à 20 ° C pendant 5 min. Après incubation, les cellules ont été récoltées à 3800 g pendant 15 min à 20 ° C, le surnageant a été jeté et les culots ont été congelés à -80 ° C pendant 72 h maximum et l'ARN a été extrait76. Les échantillons ont été décongelés à 20 ° C et remis en suspension dans 100 μL de tampon de sphéroplastie plus mutanolysine à 500 U/mL. Les cellules ont été incubées à 37°C pendant 5 min. L'ARN total a été extrait à l'aide du kit de purification d'ARN Ambion RiboPure Bacteria (Life Technologies) conformément aux instructions du fabricant. Les concentrations d'ARN ont été déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop ND‐1000 (Nanodrop Technologies, LLC, Wilmington, DE, USA). L'ARN a été analysé par électrophorèse sur gel pour assurer l'intégrité de l'ARN. Un μg d'ARN total de cellules bactériennes a été soumis à une transcription inverse à l'aide du kit QuantiTect Reverse Transcription (Qiagen, Hilden, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant.

Des mélanges de réaction RT-qPCR ont été préparés contenant 0,25 μL d'échantillons d'ADNc et le mélange QuantiTect SYBR Green (Qiagen), 1 μM d'amorce directe qRT-ssnAF et d'amorce inverse qRT-ssnAR (tableau supplémentaire 2) dans un volume total de 20 μL. Les réactions ont été réalisées en triple en utilisant QuantStudio 3 (ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) avec le programme de thermocyclage suivant : dénaturation initiale à 95 °C pendant 2 min et 40 cycles d'amplification à 95 °C pendant 15 s, 55 °C pendant 10 s et 72 °C pendant 30 s. La méthode CT comparative (ΔΔCT) a été utilisée pour analyser les données de RT-qPCR, et les données ont été normalisées par rapport au gène de l'ARNr 16 S comme référence (tableau supplémentaire 2, qRT-16S-F et qRT-16S-F). Les réactions RT-qPCR ont été validées à l'aide de l'analyse de la courbe de fusion.

Tous les graphiques ont été tracés et des tests statistiques ont été effectués à l'aide de GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla California, USA) version 9. Les détails des tests statistiques sont donnés dans les légendes des figures.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données quantitatives étayant les chiffres du manuscrit principal sont disponibles au Newcastle University Research Repository (https://doi.org/10.25405/data.ncl.21539340). D'autres données sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ce travail a été financé par une association internationale pour la recherche dentaire (IADR) Innovation in Oral Care Award (NSJ) et par le Dunhill Medical Trust (RPGF1810\101) (NSJ/AHN/KJW). KJW a été financé par le Conseil de recherche en biotechnologie et en sciences biologiques (BB/S006818/1). Le financement du doctorat pour CL provenait des National Institutes of Health (DE016690). Nous remercions Ekaterina Kozhevnikova et Philip Hardy pour leur soutien technique et l'installation centrale d'analyse des protéines et des protéomes de l'Université de Newcastle (NUPPA) pour leur aide dans la purification des enzymes.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Nadia Rostami, Robert C. Shields.

École des sciences dentaires, Faculté des sciences médicales, Université de Newcastle, Newcastle, Royaume-Uni

Nadia Rostami, Robert C. Shields, Sufian Yassin, Halah Ahmed et Nicholas S. Jakubovics

Département des sciences biologiques, Arkansas State University, Jonesboro, AR, États-Unis

Robert C. Shields

École dentaire de Bristol, Université de Bristol, Bristol, Royaume-Uni

Hannah J. Serrage, Catherine Lawler, Jane L. Brittan et Angela H. Nobbs

Département des sciences réparatrices, Université de l'Alabama à Birmingham, Birmingham, AL, États-Unis

Sufian Yassin

Installation d'analyse des protéines et des protéomes, Faculté des sciences médicales, Université de Newcastle, Newcastle, Royaume-Uni

Achim Treumann et Paul Thompson

KBI Biopharma BV, Louvain, Belgique

Achim Treuman

Institut des biosciences, Faculté des sciences médicales, Université de Newcastle, Newcastle, Royaume-Uni

Kevin J. Waldron

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Expériences conçues par NSJ, NR, AN, AT, KJW et RCS ; NR, RCS, SY, CL, JLB, PT et HA ont mené des expériences ; NSJ, NR, AN, AT, KJW et RCS ont analysé et interprété les données ; NR, RCS et NSJ ont rédigé le manuscrit ; tous les auteurs ont revu le manuscrit de manière critique et ont approuvé la version finale soumise. NR et RCS ont contribué à parts égales aux travaux.

Correspondance à Nicholas S. Jakubovics.

L'Université de Newcastle détient le brevet WO2011098579A1 « Composés désoxyribonucléases bactériennes et méthodes de perturbation et de prévention du biofilm ». Il n'y a pas d'autres intérêts concurrents.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Rostami, N., Shields, RC, Serrage, HJ et al. Compétition interspécifique dans les biofilms oraux médiée par Streptococcus gordonii désoxyribonucléase extracellulaire SsnA. npj Biofilms Microbiomes 8, 96 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00359-z

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Reçu : 15 novembre 2021

Accepté : 21 novembre 2022

Publié: 12 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41522-022-00359-z

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