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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 1539 (2023) Citer cet article

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Les processus de fossilisation et surtout le rôle de l'activité bactérienne lors de la conservation de la matière organique n'ont pas encore été bien compris. Ici, nous rapportons les résultats d'expériences taphonomiques contrôlées avec des écrevisses en eau douce et dans les sédiments. Les analyses d'amplicons d'ARNr 16S ont montré que le développement de la composition de la communauté bactérienne au fil du temps était corrélé à différents stades de décomposition et de conservation. Trois genres dominants, Aeromonas, Clostridium et Acetobacteroides ont été identifiés comme les principaux moteurs de la décomposition des écrevisses en eau douce. À l'aide de la tomodensitométrie (µ-CT), de la microscopie électronique à balayage (SEM) et de la spectroscopie confocale Raman (CRS), des amas de calcite ont été détectés après 3 à 4 jours à l'intérieur des carcasses d'écrevisses lors de leur décomposition en eau douce à 24 °C. La précipitation des amas de calcite au cours du processus de décomposition a été augmentée en présence du genre bactérien Proteocatella. Par conséquent, Proteocatella pourrait être l'un des genres bactériens responsables de la fossilisation.

Les « Konservat-Lagerstätten » abritent un enregistrement distinct de fossiles de tissus mous et, par conséquent, dépeignent la diversité des communautés anciennes1,2. Les différentes étapes qui conduisent à la fossilisation des tissus mous restent floues et, surtout, le rôle de l'activité bactérienne n'est pas bien compris. Immédiatement après la mort d'un organisme, des enzymes autolytiques, telles que des lipases, des protéases ou des amylases, commencent l'autodigestion des cellules mortes et des liquides riches en nutriments sont libérés3,4,5,6. Ces nutriments soutiennent la croissance initiale des bactéries qui produisent ensuite des exoenzymes hydrolytiques et continuent de décomposer la matière organique. La décomposition hétérotrophe peut s'accompagner de modifications de la valeur du pH. On suppose que ces changements de pH pourraient alors entraîner la libération d'ions de la matière organique et du milieu environnant. Les ions libres entravent davantage la croissance bactérienne, conduisent à une stabilisation des restes de tissus et, éventuellement, à une minéralisation authigène7,8,9,10,11,12,13. Par conséquent, l'activité bactérienne initiale semble jouer un rôle important pour une conservation exceptionnelle14,15 tant que le taux des processus de conservation ultérieurs, par exemple la minéralisation, reste supérieur aux taux de décomposition7,8,9,10,11,12,14, 16,17,18,19,20.

La plupart des recherches se concentrent sur les conditions environnementales qui réduisent l'activité bactérienne ou favorisent la précipitation des minéraux. L'activité bactérienne est fortement influencée par des facteurs abiotiques, tels que la température, le pH, la salinité ou l'oxygène. Ces paramètres impactent la capacité des souches à réussir à coloniser un habitat ou à réguler la production d'exoenzymes dégradantes spécifiques en fonction de la disponibilité des nutriments, de l'oxygène, de la densité cellulaire bactérienne et de la phase de croissance bactérienne21,22,23. Les exoenzymes comme les protéases, les chitinases ou les lipases contribuent à la décomposition des tissus mous, alors que d'autres caractéristiques métaboliques bactériennes (p. à la préservation des tissus mous. On suppose que la décomposition et la minéralisation se produisent simultanément et sont spécifiques au type de tissu13,25. La préservation des tissus mous a souvent été associée à des conditions anaérobies qui réduisent l'activité autolytique et sont supposées influencer la dégradation microbienne26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. Cependant, cela ne tient pas compte du fait que les bactéries présentent diverses adaptations à des conditions d'oxygène réduites. Par exemple, Pseudomonas tunicata, une bactérie marine aérobie, formera des pseudomorphes d'embryons marins dans des conditions aérobies, mais détruira la structure interne des cellules si l'oxygène n'est pas disponible ou épuisé31. De plus, certains organismes anaérobies obligatoires, comme les bactéries sulfato-réductrices, sont capables de dégrader la matière organique aussi rapidement que les bactéries aérobies16,36. De plus, les expériences taphonomiques n'ont toujours pas abouti à un consensus sur le rôle des conditions anaérobies sur la conservation. Alors que certains résultats indiquent une décomposition plus rapide des tissus mous dans des conditions aérobies26,27,28,37, d'autres résultats expérimentaux ne montrent aucune différence par rapport à la décomposition anaérobie16,38 ou seulement de rares différences dans diverses conditions d'oxygène39,40. En particulier, une étude a mis en évidence que certains tissus de cnidaires se décomposaient encore plus rapidement dans des conditions anaérobies41. Il a également été suggéré que des processus de minéralisation spécifiques induits par des bactéries dans des conditions anaérobies pourraient être plus importants pour la préservation des tissus que la réduction de l'activité microbienne14.

Actuellement, les connaissances sur l'impact des espèces individuelles sur les processus de décomposition et de conservation et leur origine, soit du microbiome animal (flore gastro-intestinale/tégumentale), soit du biotope dans lequel l'animal est mort (environnement), sont très limitées. Les premiers résultats ont indiqué une influence stabilisatrice des micro-organismes endogènes provenant vraisemblablement de la flore gastro-intestinale des organismes bilatéraux34, tandis qu'Eagan35 a souligné que chaque organisme présente un microbiome individuel qui peut soit favoriser la conservation, soit accélérer la décomposition. Par conséquent, des expériences taphonomiques contrôlées et soigneusement conçues se concentrant sur l'activité microbienne et les changements organiques associés dans différentes conditions environnementales sont nécessaires pour obtenir une compréhension détaillée des processus de décomposition. L'étude des processus de décomposition offre la possibilité d'identifier les phases de décomposition qui doivent être supprimées ou qui doivent avoir lieu afin de générer les conditions spécifiques nécessaires à la préservation des tissus mous.

Avec cette étude, nous voulons contribuer à l'élucidation de l'interaction complexe entre la décomposition et la préservation qui ouvre la voie à un fossile parfaitement conservé. Il s'agit de la première approche expérimentale qui a analysé le changement dépendant du temps de la composition de la communauté bactérienne pendant la décomposition ou la conservation des carcasses de Cambarellus diminutus dans des expériences d'eau douce taphonomique contrôlées par analyse d'amplicon d'ARNr 16S. Afin d'élucider le rôle de la flore intrinsèque et extrinsèque sur la dégradation ou la préservation des tissus mous, les écrevisses ont été incubées dans de l'eau de lac naturel et des sédiments à 24 °C. L'eau et les sédiments du lac autoclavés ont servi de témoins. Des conditions anaérobies et aérobies ont été utilisées pour étudier l'influence de l'anoxie sur les processus de décomposition et de conservation potentielle (Fig. 1).

Conception de montage expérimental réalisée à une température constante de 24 °C. Exp. 1 a été réalisée dans des conditions aérobies avec de l'eau non traitée et des sédiments. Exp. 2 a été réalisée dans des conditions aérobies avec de l'eau stérile et des sédiments. Exp. 3 a été réalisée dans des conditions anaérobies avec de l'eau et des sédiments non traités. Exp. 4 a été réalisée dans des conditions anaérobies avec de l'eau stérile et des sédiments.

Des individus de l'écrevisse existante Cambarellus diminutus [Hobbs 1945] ont été prélevés dans une communauté de réservoirs de reproduction élevés dans notre laboratoire. Les animaux ont été gardés dans des bacs de 54 L de 60 × 30 × 30 cm, à une température constante de l'eau de 26 °C. Les réservoirs ont été remplis d'eau de canalisation et enrichis avec un conditionneur d'eau "Biotopol C" (JBL, GmbH & Co. KG, Neuhofen, Allemagne) pour neutraliser le zinc (Zn) et le plomb (Pb) et pour éliminer le chlore (Cl) et lier le cuivre ( Cu). Les écrevisses n'ont été nourries qu'avec "Crabs Nature" (Sera, GmbH, Heinsberg, Allemagne), un aliment principal pour les écrevisses (les ingrédients peuvent être trouvés dans le tableau supplémentaire 1.

144 individus aux tripes partiellement remplies ont été sacrifiés en les plaçant dans une atmosphère de dioxyde de carbone (CO2). Les spécimens n'ont pas été séchés avant d'être pesés à l'échelle microscopique. Les longueurs ont été mesurées de la pointe antérieure du céphalothorax à l'extrémité du pleon sans le telson (tableaux supplémentaires 2a, b). Des informations sur la position zoologique systématique et la construction générale de la cuticule de Cambarellus diminutus et le cycle de mue sont fournies dans les informations supplémentaires (Fig. 1 et 2 supplémentaires).

Dans l'étude, quatre configurations expérimentales différentes ont été menées à une température constante de 24 ° C (Fig. 1 et Fig. 3 supplémentaire). Deux expériences ont été lancées dans des conditions aérobies, l'une avec de l'eau de lac non traitée et des sédiments (Exp. 1) et l'autre avec de l'eau stérile et des sédiments (Exp. 2). Deux autres expériences ont également été réalisées avec des sédiments et de l'eau non traités (Exp. 3) et stériles (Exp. 4), mais des conditions anaérobies ont été établies grâce à des systèmes de génération de gaz spécifiques (Fig. 1).

Pour toutes les expériences, 184 tubes Falcon stériles (50 ml) ont été remplis avec ~ 6 g de sédiments proches du rivage, prélevés dans un lac d'eau douce appelé "Alte Tongrube" à Bonn-Röttgen, Allemagne (50°40′24,7″N/7°04 ′29.6″E). 144 spécimens ont été déposés chacun sur le sédiment dans un de ces tubes Falcon et 40 tubes Falcon sont restés sans spécimen d'écrevisse et ont servi d'échantillons à blanc. Tous les tubes ont été remplis avec ~ 40 ml d'eau du lac, prélevée dans la même localité. Pour les expériences stériles (Exp. 2 et 4), l'eau et le sédiment ont été autoclavés pendant au moins 20 min à 121 °C. Toutes les expériences ont été mises en place sous une hotte à flux laminaire. Des expériences dans des conditions de départ anaérobies (Exp. 3 et 4) ont été préparées avec l'ajout de 10 mM de β-mercaptoéthanol (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, GER) comme agent réducteur. Des conditions anaérobies ont été établies avec des systèmes générateurs de gaz BD Difco™ GasPak™ EZ Anaerobier Pouch System (BD Becton, Dickinson and Company, États-Unis). Chaque expérience a eu sept jours d'échantillonnage (jours 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21) au cours desquels les changements morphologiques de deux animaux ont été analysés. Une attention a été portée à la couleur de la cuticule, à l'accumulation de gaz et aux désarticulations. Les spécimens ont ensuite été disséqués et examinés avec un stéréomicroscope (Stemi 2000; Carl Zeiss Microscopy Deutschland GmbH, Oberkochen, Allemagne). L'analyse au cours de la dissection a porté sur les modifications internes des organes suivants : branchies, glande digestive, estomac, intestin, cordon nerveux ventral et tissu musculaire (Fig. 2). L'image du conglomérat de calcite de la Fig. 3 a été photographiée avec un stéréo-zoom-microscope (Axio Zoom. V16, Carl Zeiss Microscopy Deutschland, Oberkochen, Allemagne). Les chiffres finaux ont été créés à l'aide d'Adobe Photoshop CS5 (Adobe, Dublin, République d'Irlande) avec 300 dpi.

Abondance en fonction du temps des genres dominants et décomposition optique des zones corporelles et des organes internes d'écrevisses en décomposition pendant une durée de 21 jours à 24 °C.

Précipitation de calcite à l'intérieur d'écrevisses en décomposition. (a) Valeur médiane de l'augmentation du volume total de calcite d'Exp. 1–4 pour une durée de 21 jours à une température constante de 24 °C, y compris un modèle 3D translucide d'un individu montrant des modèles 3D reconstruits d'amas de calcite sur la face interne de la cuticule (structures jaunes). ( b ) Spectres Raman représentatifs des amas de cristaux observés par rapport aux spectres de référence Raman de l'apatite cristalline, de l'aragonite et de la calcite, tirés de la base de données RRUFF Raman (# R060070, 0R060070, * R04017042). Les spectres Raman des amas de cristaux présentent des bandes Raman principales généralement pour la calcite cristallisée et le β-carotène, l'astaxanthine. ( c ) Image optique d'un amas de calcite semi-circulaire avec trois soies minéralisées (flèches roses). ( d ) Image SEM de l'amas de calcite illustré en ( c ).

Trois autres spécimens d'écrevisses ont été utilisés pour l'extraction d'ADN afin d'analyser les changements microbiologiques. Pour surveiller les changements dans le microbiome et l'eau et les sédiments environnants en l'absence d'écrevisses, des échantillons vierges sans tissu ont été mis en œuvre les jours 1, 7, 14 et 21 et tous les tests ont été effectués en triple comme témoins. Au début de chaque expérience, les carcasses étaient entièrement articulées et de couleur bleue. De plus, aucun organisme symbiotique, parasite ou commensal n'a été trouvé sur les carcasses.

Avant l'extraction de l'ADN, les échantillons d'eau ont été filtrés avec des filtres PORAFIL® NC (d = 0,25 µm ; Macherey–Nagel GmbH & Co. KG, GER). Les filtres ont ensuite été coupés en petits morceaux et transférés dans des tubes de lyse ZR BashingBead™ (0,1 et 0,5 mm) avec 750 µL de solution de lyse ZymoBIOMICS. Le battage des billes des filtres et des échantillons de tissus a été effectué avec un homogénéisateur Precellys® (Bertin Technologies SAS, Montigny Le Bretonneux, FR), 6000 × g pendant 30 s. L'ADN a été extrait avec le kit ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep (Zymo Research, USA) conformément aux instructions du fabricant. L'ADN a été élué dans 50 µL d'eau sans DNase/RNase et la concentration d'ADN en ng par µL a été déterminée par un spectrophotomètre NanoDrop™ OneC Microvolume-UV/VIS (Thermo Fisher Scientific Inc., USA).

Pour le séquençage du gène de l'ARNr 16S, la région variable V4 de la séquence du gène de l'ARNr 16S a été amplifiée avec les amorces 16S spécifiques de 16s-515F (GTG CCA GCM GCC GCG GTA A) et 16s-806R (GGA CTA CVS GGG TAT CTA AT)43 . La réaction PCR a été réalisée en une seule étape PCR avec le kit HotStarTaq Plus Master Mix (Qiagen, États-Unis) et comprenait une dénaturation initiale à 95 °C pendant 5 min, suivie de 30 à 35 cycles de 95 °C pendant 30 s, 53 ° C pendant 40 s et 72 ° C pendant 1 min, avec une étape d'élongation finale à 72 ° C pendant 10 min. Le séquençage terminal apparié (bTEFAP®) a été réalisé par Molecular Research DNA (http://www.mrdnalab.com, Shallowwater, États-Unis) sur un MiSeq conformément aux directives du fabricant44. Les données de séquence brutes ont été traitées via le QIIME245 avec des paramètres par défaut, sauf indication contraire. Le pipeline DADA2 a été utilisé pour le contrôle de la qualité des séquences, le débruitage et le filtrage chimérique46. La classification taxonomique des ASV finaux (variante de séquençage d'amplicon), regroupés à 99 % d'identité, a été réalisée avec un classificateur bayésien naïf qui a été entraîné contre la version 138 de la base de données SILVA, en particulier pour la région d'ARNr 515F/806R47,48.

Chaque jour d'échantillonnage, des échantillons d'eau et de tissus ont été préparés pour la culture d'espèces bactériennes. En bref, la surface du tissu d'écrevisses a été écouvillonnée pour l'isolement des espèces formant un biofilm. L'écouvillon a été incubé dans un milieu tryptone soja bouillon (TSB) plus 1 % de glucose dans dix dilutions différentes pendant 3 jours à 30 °C, puis étalé sur de la gélose Columbia avec 5 % de sang de mouton (COL [BD™, Becton, Dickinson and Company, New Jersey, États-Unis]) pour une culture ultérieure. De plus, 50 µL des échantillons d'eau ont été striés sur des plaques de gélose sélective (par exemple, R-2A [Sigma-Aldrich, St. Louis, USA], MacConkey agar [BD™, Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA], milieu LB minimal [tryptone 2,5 g/L, NaCl 2,5 g/L, extrait de levure 1,25 g/L, gélose 18 g/L, pH 7,5]) et incubé jusqu'à 1 semaine à 30 °C. Un isolement supplémentaire a été réalisé sur gélose COL. Des cultures pures ont été identifiées par spectroscopie de masse à désorption/ionisation laser assistée par matrice (Microflex® LT MALDI-TOF/MS Bruker Corporation, Billerica, États-Unis) ou par séquençage du gène de l'ARNr 16S. Le séquençage a été réalisé par GATC Biotech AG (GER) et les séquences ont été comparées à la base de données EZBioCloud49.

L'analyse des métriques de diversité alpha a été réalisée à l'aide du package R "vegan" (version 2.5.650. Les visualisations des statistiques et de la composition de la communauté microbienne ont été réalisées avec le package R "ggplot2"51.

Pendant les 4 premiers jours, trois spécimens d'Exp. 1 à 4 (E1-21.1 à E1-21.3 ; E2-21.1 à E2-21.3 ; E3-21.1 à E3-21.3 ; E4-21.1 à E4-21.3) ont été initialement scannés une fois par jour, suivis de scans après 7, 14 et 21 jours à l'aide d'un scanner phoenix|x-ray v|tomex s 240 micro-computed-tomography (µ-CT) (GE Measurement & Control, GER) situé à l'Institut des géosciences de l'Université de Bonn. Chaque ensemble de données a une résolution de 38 µm ; les balayages ont été effectués à 80 kV et 100 µA. Trois images par projection ont été acquises avec un timing de 500 ms pour un total de 1000 projections. Les données µ-CT ont été traitées à l'aide du logiciel VG Studio Max 3.2 (Volume Graphics, Heidelberg, Allemagne [https://www.volumegraphics.com/de/produkte/vgsm/whats-new-in-vgstudio-max-3-2 -x.html]) et Avizo 8.0 (Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Allemagne [https://www.thermofisher.com/de/de/home/electron-microscopy/products/software-em-3d-vis/avizo- software.html]) pour reconstruire et visualiser les amas de cristaux précipités à l'intérieur des spécimens et les gastrolithes situés à l'intérieur de l'estomac. De plus, Avizo 8.0 a été utilisé pour les mesures de volume de modèles de surface 3D polygonaux.

Des amas de cristaux (le cas échéant) ont été obtenus à partir des carcasses et analysés avec un spectromètre Raman confocal LabRam HR800 (Horiba Scientific) situé à l'Institut des géosciences de l'Université de Bonn. Une diode laser de 100 mW 784 nm comme source d'excitation, un réseau de 600 rainures/mm et un objectif 100 × avec une ouverture numérique de 0,9 ont été utilisés. La taille du trou confocal et la taille de la fente d'entrée du spectromètre ont été fixées à 1000 et 100 µm, respectivement. Avec ces paramètres, la résolution spectrale était de 4,6 cm-1. Le temps d'exposition total était de 2 min avec quatre accumulations de 30 s.

Les amas de cristaux (le cas échéant) ont été disséqués et recouverts d'une fine couche d'or avec une couche de pulvérisation froide (Cressington Sputter Coater 108 manual, Tescan GmbH, Dortmund, Allemagne). Les échantillons ont ensuite été scannés avec une unité de microscope électronique à balayage (SEM) "environnemental" (TESCAN VEGA 4 LMU) en utilisant le détecteur SE à 20 keV. Les images ont 1536 × 1331 pixels et 16 bits. La distance de travail de chaque image SEM peut être trouvée dans les légendes des figures.

Dans l'eau de lac non traitée dans des conditions aérobies (Exp. 1), un changement de couleur des cuticules et une forte odeur de pourriture ont été observés au jour 2. Des observations comparables ont été faites dans de l'eau de lac stérilisée dans des conditions aérobies (Exp. 2) et anaérobies (Exp 4) après 3 jours et également après 4 jours dans des conditions anaérobies dans de l'eau de lac non traitée (Exp. 3) (Fig. 2 et Tableau supplémentaire 3). Au jour 7, les cuticules des écrevisses sont apparues molles et gélatineuses dans toutes les expériences.

Dans des conditions anaérobies (Exp. 3 et 4), quel que soit le traitement de l'eau, les muscles initialement blancs ont montré une décoloration rose au jour 3, alors que les mêmes changements ont été observés au jour 4 dans des expériences qui ont commencé dans des conditions aérobies (Exp. 1 et 2).

Chez tous les individus de toutes les expériences, l'estomac s'est décomposé dans les 4 premiers jours (Fig. 2), ainsi que la glande digestive chez les individus, qui avaient été incubés dans des conditions anaérobies. Dans des conditions aérobies, la glande digestive a pu être identifiée pendant au moins 1 semaine. Passé ce délai, les muscles étaient pulpeux et les cuticules translucides et gélatineuses. Le cordon nerveux ventral, l'intestin et les branchies n'étaient plus visibles chez aucun des animaux, à l'exception des branchies chez les individus d'Exp. 2 (aérobie, stérile) (Fig. 2), visibles jusqu'au jour 14.

Après 2 semaines, le sédiment et les carcasses d'Exp. 1 à 3 étaient recouverts d'une couche noire apparue dans Exp. 4 (anaérobie, stérile) seulement après 21 jours. De plus, une accumulation de gaz de putréfaction a été remarquée autour de la zone branchiale chez les individus d'Exp. 1 (aérobie, non traité), ce qui a entraîné un céphalothorax flottant détaché de l'individu E1-21.1 au jour 24, 3 jours après la période d'étude régulière (Fig. 4a supplémentaire). Le céphalothorax de l'individu E1-21.3 n'était que partiellement détaché du pléon et flottait, tenant les restes du corps pendant, également au jour 24 (Fig. 4b supplémentaire).

Aucune accumulation de gaz n'a été remarquée dans aucun spécimen des autres expériences, mais nous avons observé une séparation du pléon du céphalothorax chez les individus d'Exp. 2 (aérobie, stérile) après 7 jours et dans des spécimens d'écrevisses d'Exp. 3 (anaérobie, non traité) après 2 semaines.

Pour analyser la succession temporelle de la composition de la communauté microbienne (MCC) dans les quatre expériences, nous avons effectué le séquençage de l'amplicon d'ARNr 16S à sept moments avec trois répliques biologiques indépendantes. La succession bactérienne au sein des triplicats était comparable et permettait une interprétation de tendances distinctes. Le MCC des sédiments était stable au fil des saisons (tableau supplémentaire 4). La diversité α, calculée via l'indice de Shannon52, a diminué dans toutes les conditions au cours des 3 premiers jours. Dans les expériences de contrôle (Exp. 2 : aérobie, stérile ; Exp. 4 : anaérobie, stérile), la diversité est restée stable autour d'un indice de Shannon de ~ 1,5, alors que dans les expériences avec l'eau naturelle du lac, une légère augmentation a pu être détectée jusqu'à la fin des expériences (cf. tableau complémentaire 5 ; Fig. complémentaire 5). Dans toutes les expériences, les échantillons des premiers jours étaient caractérisés par de grandes quantités de protéobactéries, mais après 4 jours, les phyla Firmicutes et Bacteroidetes sont devenus dominants (cf. tableau supplémentaire 6). Après la consommation d'oxygène résiduel, les bactéries anaérobies obligatoires ont pris le relais dans tous les échantillons. Le MCC dans les expériences réalisées avec de l'eau de lac non traitée et des sédiments (Exp. 1 et Exp. 3) a d'abord été dominé par Aeromonas sp. Ces bactéries étaient déjà présentes sur les animaux au jour 1 (tableau complémentaire 7). Les aéromonades ont été supplantées par Clostridium sp. pendant la partie médiane de l'expérience. Après l'effondrement de l'estomac et de la glande digestive des individus d'écrevisses, les espèces du genre Acetobacteroides ont augmenté. De faibles abondances de Proteocatella sp. ont été trouvés dans Exp. 1 (aérobie, non traité) et Exp. 3 (anaérobie, non traité), alors que ce genre était absent des témoins stériles (Exp. 2 et Exp. 4). Ici, les MCC différaient les uns des autres. Exp. 4 (anaérobie, stérile) a montré une progression bactérienne comparable à Exp. 1 et exp. 3 (tous deux non traités), bien qu'Aeromonas sp. ont montré un bloom biphasique dans les deux expériences témoins (Exp. 2 et Exp. 4), c'est-à-dire une diminution temporaire qui s'est accompagnée d'une augmentation de Clostridium sp. pour quelques jours. La désintégration initiale dans Exp. 4 (anaérobie, stérile) a montré la présence de Candidatus Bacilloplasma sp. et Bacillus sp., tandis que les animaux en décomposition de Exp. 2 (aérobie, stérile) ont été colonisés par des bactéries sporulées du genre Sporobacter (groupe Ruminococcaceae NK4A214) et Ruminiclostridium dans les échantillons finaux (Fig. 2 et Tableau supplémentaire 8 pour MMC de tous les genres). Les souches bactériennes isolées et leurs propriétés sont présentées dans le tableau supplémentaire 9.

Les images µ-CT ont révélé la précipitation d'amas de cristaux dans toutes les configurations expérimentales, en commençant par les chélipèdes du spécimen individuel E2-21.2 dans Exp. 2 déjà après 2 jours ou après 3 jours dans les spécimens E2-21.3, E3-21.2 et E4-21.3. Après 4 jours, des amas de cristaux se sont précipités chez tous les individus (tableau supplémentaire 10a). Au fur et à mesure de la décomposition, des structures cristallines ont été observées sur la face ventrale du céphalothorax, à l'intérieur des péréiopodes, à l'intérieur de la coxa des pléopodes, le long de la face ventro-latérale des tergites, dans le telson et les uropodes. De plus, les images µ-CT ont révélé que ces amas de cristaux ne précipitaient que sur la face interne des cuticules. Tous les spécimens numérisés d'Exp. 1 (aérobie, non traité) et Exp. 2 (aérobie, stérile) contenait une paire de gastrolithes. Les mesures de volume de modèles polygonaux de surface 3D d'amas de cristaux et de gastrolithes ont montré une augmentation du volume des amas de cristaux et simultanément une réduction du volume des gastrolithes avec une décomposition progressive (tableau supplémentaire 10b). Il est important de noter que dans les expériences menées dans des conditions stériles (Exp. 2 et Exp. 4), un plus petit volume total d'amas de cristaux a été observé par rapport aux expériences menées avec des sédiments et de l'eau non traités (Exp. 1 et Exp. 3). De plus, le volume total des amas de cristaux dans Exp. 4 (anaérobie, stérile) a diminué avant la fin de l'expérience (Fig. 3a).

Les analyses Raman ont clairement révélé que les amas de cristaux étaient constitués de cristaux de calcite bien ordonnés (Fig. 3b), qui peuvent être identifiés par la bande vibrationnelle d'étirement v1(CO3) entièrement symétrique près de 1085 cm−1 ainsi que la présence de bandes près de 154 et 281 cm−1 qui sont attribués aux vibrations du réseau de calcite, ces dernières étant absentes dans le carbonate de calcium amorphe (ACC). De plus, certaines analyses Raman des amas de cristaux ont montré un spectre mixte avec des bandes fondamentales de calcite cristalline et le β-carotène, l'astaxanthine (AXT) (Fig. 3b) qui a été identifié par les modes de haute intensité typiques près de 1157 et 1517 cm− 1 qui sont attribués aux vibrations d'étirement C = C et C – C des liaisons de la chaîne polyène, respectivement 53, 53, 55. Par rapport au spectre obtenu à partir de la norme AXT, une déviation faible mais nette de la fréquence de la bande ~ 1517 cm−1 a été observée, ce qui peut vraisemblablement être lié aux différences structurelles dans l'AXT.

Les images SEM ont montré plusieurs structures d'amas de calcite précipitée (Fig. 6a – f supplémentaires) variant en tailles de 100 à 900 µm à la fin de l'expérience. Une structure de calcite a été trouvée à l'intérieur d'un péréiopode de l'individu E1-21.3 avec des restes de cuticule minéralisés et trois soies plumeuses (Fig. 3c, d). La plupart des amas de calcite étaient sphériques (Fig. 6d supplémentaire) ou bisphériques. Certains amas de cristaux étaient plus ou moins elliptiques avec un ou deux épaississements arrondis à une extrémité (Fig. 6c, e, f supplémentaires). Toutes les structures de calcite présentaient des décolorations rougeâtres et ont été découvertes sur la face interne des cuticules (Fig. 3c et Fig. 6a supplémentaire).

Il s'agit de la première étude détaillée de la succession bactérienne dans la décomposition des tissus mous et la préservation des arthropodes en eau douce. Les analyses microbiennes au cours de la décomposition de l'écrevisse C. diminutus sous différents paramètres prédéfinis ont montré des successions communautaires reproductibles dans toutes les expériences. Les bactéries anaérobies facultatives qui dominaient les tissus au début de nos expériences et qui sont capables de se développer aussi bien en présence qu'en l'absence d'oxygène, ont été rapidement supplantées par les organismes anaérobies obligatoires. Des changements similaires ont également été décrits en médecine légale pour la décomposition terrestre des souris, des porcs et des humains56,56,57,59. Après 7 jours, la flore bactérienne change souvent en raison d'une diminution des nutriments et du besoin de voies métaboliques alternatives pour générer de l'énergie60, ce qui a également été détecté chez Exp. 1 (aérobie, non traité), Exp. 3 (anaérobie, non traité) et Exp. 4 (anaérobie, stérile). Initialement, les carcasses en décomposition étaient habitées par le phylum Proteobacteria, tandis que plus tard, principalement des Firmicutes et des Bacteroidetes ont été détectés (voir le tableau supplémentaire 6)58,61,62. Le microbiome des écrevisses en décomposition comprenait trois genres dominants, Aeromonas, Clostridium et Acetobacteroides. Dans toutes les expériences, le genre Aeromonas a colonisé les carcasses au cours de la phase initiale et a atteint un nombre maximal aux jours 2 et 3. Ces bactéries aquatiques anaérobies facultatives sont omniprésentes63 et jouent un rôle important dans la décomposition des carcasses dans l'eau douce et saumâtre64,65. Ce sont également des agents pathogènes, provoquant des infections chez les poissons et d'autres animaux, ainsi que chez les humains immunodéprimés66. Les espèces pathogènes A. hydrophila, A. salmonicida et A. veronii ont été isolées des expériences et confirment le rôle prédominant d'Aeromonas dans la décomposition des organismes aquatiques comme démontré pour les poissons par Lobb62. De nombreux isolats étaient des formateurs de biofilm. Domination d'Aeromonas sp. dans le processus de décomposition initial peut s'expliquer par la sécrétion de diverses exoenzymes, telles que des hémolysines, des protéases, des chitinases ou des lipases spécifiques qui contribuent à la lyse de la cellule hôte62,67,67,68,69,71.

Après 2 ou 3 jours, la quantité de Clostridium a augmenté dans toutes les expériences en même temps qu'une diminution d'Aeromonas et a atteint son maximum au jour 7. Les Clostridium sont associés à des infections anaérobies et à la décomposition des tissus humains et animaux30,58,61,62,72 et se trouvent couramment dans le tractus gastro-intestinal de divers organismes et dans le sol73,74. Puisqu'ils étaient également présents dans les témoins stériles et pouvaient rarement être détectés dans les sédiments (voir le tableau supplémentaire 4), ils doivent provenir du tractus gastro-intestinal des écrevisses ou des spores présentes à la surface du corps. Ce genre est également fréquemment détecté dans les expériences médico-légales56,58,60,61. Certaines espèces de ce genre sont capables de cliver le collagène et l'acide hyaluronique et de produire des toxines qui détruisent les membranes cellulaires, entraînant la libération de nutriments frais des cadavres75,75,76,78. Par conséquent, un manque de nutriments peut avoir contribué à la diminution des aéromonades qui colonisaient la carcasse en premier lieu. L'anoxie faisait partie de la configuration expérimentale d'Exp. 3 et exp. 4 ou développé par l'activité microbienne dans Exp. 1 et exp. 214. Plus tard, dans toutes les expériences Aeromonas sp. et Clostridium sp. ont été supplantés par les Rikenellaceae (Acetobacteroides sp.) après le jour 7, sauf chez Exp. 2 (aérobie, stérile) dans laquelle ce genre était absent et une augmentation secondaire des aéromonades a été observée. Acetobacteroides spp. sont strictement anaérobies et fermentent les sucres polymères (glycogène), les hexoses, les pentoses et la tryptone en acétate, CO2 et H279. L'augmentation de ce genre s'est produite simultanément avec l'effondrement de l'estomac et de la glande digestive, qui est un organe de stockage du glycogène chez les crustacés80, indiquant que la libération de substrats par la dégradation de ces organes riches en nutriments pourrait avoir favorisé la prolifération d'Acetobacteroides sp. ou que ce genre est un habitant naturel de ces parties du corps. L'intestin de la crevette de rivière orientale Macrobrachium nipponense, qui est une espèce de l'ordre des décapodes comme C. diminutus, abrite des membres d'Acetobacteroides81. Il est à noter que les témoins tissulaires au jour 1 présentaient également des espèces apparentées (voir le tableau supplémentaire 7) et, par conséquent, l'absence d'Acetobacteroides dans Exp. 2 est surprenant.

La précipitation minérale est souvent une étape importante dans la préservation des organismes à corps mou82. Dans toutes les expériences, la précipitation de cristaux de calcite a été détectée sur la face interne des carapaces d'écrevisses, bien qu'à des degrés divers. Dans Exp. 1 et 3 (non traité) un volume de calcite précipité plus important, indépendamment de la teneur en oxygène, que dans Exp. 2 et 4 (stérile) (Fig. 3a). Le volume total de calcite (TVC) dans Exp. 4 ont même diminué au jour 7, ce qui peut s'expliquer par une acidification du pH par activité microbienne à l'intérieur des échantillons83. Le pH s'est avéré dépendre du substrat qui est dégradé et peut changer en fonction des voies métaboliques actives dans l'échantillon et, à son tour, influencer l'environnement chimique local et la précipitation minérale dans les expériences taphonomiques39,84,85. Pour les écrevisses, il a été observé que la précipitation de calcite dépend de la taille corporelle et/ou du stade de la phase de mue en cours83. Au début de chaque phase de mue, les ions calcium de la cuticule sont dissous hors des couches de la cuticule et sont transportés via le système circulatoire hémolymphatique à l'intérieur de la paroi de l'estomac cardiaque et des nodules de stockage de calcium appelés "gastrolithes" se forment, qui consistent en un réseau de fibres de protéine-chitine et carbonate de calcium amorphe (ACC)86,87. Ces ions calcium ne sont donc disponibles que dans une mesure limitée pour la précipitation de calcite après la mort83. Cependant, étant donné que les individus comparés différaient rarement en taille corporelle (voir les tableaux supplémentaires 2a, b) et les stades de mue (tableau supplémentaire 10b), ces facteurs ne peuvent pas expliquer les différences significatives dans les précipitations de calcite.

Les résultats du séquençage du microbiome ont révélé la présence du genre Proteocatella dans les échantillons d'Exp. 1 et exp. 3 dans l'eau de lac non traitée, alors qu'il était absent dans Exp. 2 et exp. 4 (témoins stériles). Jusqu'à présent, seule l'espèce type, Proteocatella sphenisci, a été cultivée. Il a été isolé des excrétions du manchot de Magellan (Spheniscus magellanicus88) qui se nourrit de poissons et de crustacés. Des membres non cultivés du genre Proteocatella ont été décrits dans les eaux usées, les rivières, l'eau potable et le microbiote intestinal89,89,91. Cependant, le genre fait également partie du microbiome des thrombolites carbonisées trouvées dans les eaux douces subpolaires peu profondes de Laguna Larga dans le sud du Chili92. Un autre fait intéressant est que Proteocatella spp. est connu comme un composant de la plaque dentaire féline93 et canine94,95 qui peut se minéraliser et devenir du tartre dentaire96. Par conséquent, les espèces du genre Proteocatella pourraient avoir soutenu la précipitation de calcite dans les carcasses d'écrevisses d'Exp. 1 et exp. 3 et pourrait être l'un des genres responsables de la fossilisation. Oscillibacter sp. et Desulfovibrio sp. n'étaient également présents que dans les expériences avec de l'eau non stérilisée, bien qu'en faible abondance. Les deux genres ont été associés à la minéralisation97,97,99 ou à la formation de plaques100.

Il a été largement admis que les conditions anaérobies et surtout réductrices ralentissent la dégradation des tissus mous29,30,31,32,33,34,35, car elles inhibent les enzymes autolytiques qui sont responsables des processus de décomposition initiaux et excluent les charognards externes et, par conséquent, bioturbation31,38,101. Cependant, dans nos expériences, le tissu d'écrevisses a été dégradé de manière comparable dans des conditions de départ anaérobies et aérobies. Cela est très probablement dû à la mise en place de conditions anaérobies dans toutes les configurations expérimentales en peu de temps car une aération artificielle par incubation sur agitateur orbital aurait détruit les carcasses et n'était donc pas possible9,14,26,85. Une autre explication des schémas de décomposition comparables pourrait être une inhibition insuffisante de l'activité autolytique dans les expériences. En présence d'oxygène, l'estomac se décompose au bout de 2 jours (Exp. 1, Exp. 2), alors qu'en conditions anaérobies cet organe reste intact jusqu'au jour 3 (Exp. 3, Exp. 4), contrairement à la glande digestive, qui se décompose plus tard dans un environnement oxique. Avant la décomposition, les muscles ont montré un changement de couleur du blanc au rose qui a été détecté plus tôt dans des conditions anaérobies que dans des conditions aérobies, probablement causé par la libération et la diffusion d'astaxanthine (AXT), un pigment normalement lié au complexe protéique α-crustacyanine dans le carapace de crustacés vivants102. En fait, la diffusion de l'astaxanthine dans les amas de calcite, qui avaient précipité à l'intérieur de la cuticule, a également été observée (Fig. 3b, c).

D'autres expériences pourraient également détecter aucune16, 38, 39, 40 ou rarement une différence de taux de décomposition dans diverses conditions d'oxygène. Hancy et Antcliffe41 ont même montré que certaines structures tissulaires sont mieux conservées en présence d'oxygène. Dans des expériences précédentes, des conditions réductrices ont été établies par incubation de petits organismes avec du β-mercaptoéthanol34,35,103. Nos résultats indiquent que la concentration de l'agent réducteur doit être adaptée à la taille corporelle des organismes car les protocoles précédents ne pouvaient pas garantir une inhibition efficace des processus autolytiques.

Le microbiome des organismes est individuel et, par conséquent, peut influencer différemment la dégradation et la préservation35,104 et, par conséquent, permet l'hypothèse d'un potentiel de conservation individuel dans la nature. Cependant, dans ces expériences, tous les animaux provenaient du même réservoir et les répliques biologiques présentaient les mêmes tendances de succession microbienne et de dégradation des tissus. L'analyse de l'origine des organismes dégradants ou conservateurs était complexe et la plupart des bactéries dominantes se retrouvaient aussi bien dans les tissus que dans l'eau et les sédiments. De plus, l'analyse de la composition de la communauté microbienne et de son influence sur la décomposition et la préservation des tissus mous est entravée par des bactéries qui présentent un comportement variable sous différentes compositions environnementales, comme le décomposeur marin P. tunicata31. Pour obtenir de plus amples informations sur le comportement des bactéries et leurs voies métaboliques actives, une analyse du transcriptome doit être effectuée.

En conclusion, une succession de décomposeurs fixes d'Aeromonas, de Clostridium et d'Acetobacteroides reproduisant étroitement le "nécrobiome" décrit pour les poissons d'eau douce62 a été observée dans différentes conditions expérimentales pour Cambarellus diminutus. La présence de ces bactéries s'accompagnait de la formation de calcite cristalline chez les animaux et était particulièrement prononcée en présence du genre Proteocatella.

Toutes les données de séquence brutes liées à cette étude sont déposées dans la base de données European Nucleotide Archive (ENA) (European Bioinformatics Institute, EMBL-EBI), un partenaire de collaboration de l'International Nucleotide Sequence Database (INSDC), [Study-Accession Number: PRJEB51206]. https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB6609.

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Nous remercions JA Schultz et R. Schellhorn pour les discussions fructueuses et nous remercions T. Martin de nous avoir fourni l'appareil µ-CT (tous Section Paléontologie, Institut des Géosciences). Nous remercions O. Dülfer, P. Göddertz, G. Oleschinski pour leur soutien (tous Section Paléontologie, Institut des Géosciences). J. Rust et G. Bierbaum sont financés par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation)—Projekt-Nummer 386704301 dans le cadre de l'unité de recherche DFG FOR2685 "The Limits of the Fossil Record: Analytical and Experimental Approaches to Fossilization (Projektnummer 348043586)." Il s'agit de la contribution numéro 50 de l'unité de recherche DFG FOR2685.

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Bastian Mähler et Kathrin Janssen.

Section Paléontologie, Institut des géosciences, Rheinische Friedrich-Wilhelms Universität Bonn, 53115, Bonn, Allemagne

Bastian Mähler & Jes Rust

Institut de microbiologie médicale, d'immunologie et de parasitologie, Faculté de médecine, Rheinische Friedrich-Wilhelms Universität Bonn, 53127, Bonn, Allemagne

Kathrin Janssen et Gabrielle Bierbaum

Section Géochimie, Institut des géosciences, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, 53115, Bonn, Allemagne

Mara Iris Lönartz, Markus Lagos et Thorsten Geisler

Institut de recherche sur l'énergie et le climat (IEK-6) : Gestion des déchets nucléaires, Forschungszentrum Jülich GmbH, 52428, Jülich, Allemagne

Mara Iris Lönartz

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BM et KJ ont contribué à parts égales à ce travail. Conceptualisation : JR, BM, GB Acquisition de financement : GB, JR Enquête : KJ, BM, MIL, ML Conservation des données : KJ, BM, TG Rédaction - ébauche originale : KJ, BM Révision et édition : KJ, BM, MIL, ML, TG, GB

Correspondance à Bastian Mähler ou Kathrin Janssen.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Mähler, B., Janssen, K., Lönartz, MI et al. Déplacements microbiens dépendant du temps lors de la décomposition des écrevisses dans l'eau douce et les sédiments dans différentes conditions environnementales. Sci Rep 13, 1539 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28713-x

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Reçu : 24 juillet 2022

Accepté : 23 janvier 2023

Publié: 27 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-28713-x

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