Un organe

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8062 (2023) Citer cet article

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La surveillance continue de la microphysiologie tissulaire est une caractéristique clé de l'approche organe sur puce (OoC) pour le dépistage in vitro des médicaments et la modélisation des maladies. Les unités de détection intégrées sont particulièrement pratiques pour la surveillance microenvironnementale. Cependant, les mesures sensibles in vitro et en temps réel sont difficiles en raison de la petite taille inhérente des dispositifs OoC, des caractéristiques des matériaux couramment utilisés et des configurations matérielles externes requises pour prendre en charge les unités de détection. Nous proposons ici un dispositif OoC hybride silicium-polymère qui englobe la transparence et la biocompatibilité des polymères au niveau de la zone de détection, et possède les caractéristiques électriques intrinsèquement supérieures et la capacité de loger l'électronique active du silicium. Ce dispositif multimodal comprend deux unités de détection. La première unité consiste en un transistor à effet de champ à grille flottante (FG-FET), qui est utilisé pour surveiller les changements de pH dans la zone de détection. La tension de seuil du FG-FET est régulée par une grille à couplage capacitif et par les changements de concentration de charge à proximité immédiate de l'extension de la grille flottante, qui fonctionne comme l'électrode de détection. La deuxième unité utilise l'extension du FG comme microélectrode, afin de surveiller le potentiel d'action des cellules électriquement actives. La disposition de la puce et son emballage sont compatibles avec les configurations de mesure multi-électrodes, qui sont couramment utilisées dans les laboratoires d'électrophysiologie. La détection multifonctionnelle est démontrée en surveillant la croissance de neurones corticaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Notre capteur multimodal est une étape importante dans la surveillance combinée de différents paramètres physiologiquement pertinents sur le même appareil pour les futures plateformes OoC.

Les organes sur puces (OoC) sont des dispositifs de culture tissulaire dynamique qui visent à imiter les environnements microphysiologiques des organes in vitro. Ils ont été utilisés pour améliorer la pertinence de la modélisation des maladies et l'efficacité du développement de médicaments1. L'intégration de la microfluidique dans les puces est à l'avant-garde du domaine de l'analyse de la formulation chimique des cellules2, qui est cruciale, par exemple, pour la surveillance de la cytotoxicité3 et le diagnostic des tumeurs4. Cependant, en récapitulant les aspects de la physiologie des organes sur puce, plusieurs aspects doivent être pris en compte, tels que les forces mécaniques exercées sur les tissus, la signalisation électrophysiologique parmi les types de cellules électriquement actives et la surveillance des signaux biologiques dans la matrice extracellulaire. Ces aspects des OoC ont la capacité d'améliorer la fiabilité et la pertinence physiologique du système5. À cet égard, la surveillance continue et en temps réel des signaux biologiques des cultures cellulaires sans techniques de marquage optique terminal est cruciale. Par conséquent, l'intégration de plusieurs capteurs dans les OoC pour les mesures en temps réel devient la norme, en particulier pour les signaux environnementaux, tels que le pH ou les niveaux d'oxygène6, où la détection électrochimique est particulièrement pratique. La performance des unités de détection est donc critique. Afin d'augmenter l'amplification du signal de sortie sans avoir besoin de circuits externes, des transistors à effet de champ (FET) ont été mis en œuvre en tant que capteurs électrochimiques pour extraire des informations biochimiquement pertinentes7. En fonction du revêtement des électrodes du transistor, une sélectivité vis-à-vis d'analytes spécifiques a été démontrée, comme dans le cas des FET sensibles aux ions (ISFET). Les ISFET sont utilisés depuis plus de 50 ans pour détecter les variations de charge8. Cependant, les ISFET ont généralement besoin d'une électrode de référence externe et encombrante, qui peut difficilement être intégrée dans les dispositifs OoC de petite taille. De plus, l'électrode de référence est généralement basée sur Ag/AgCl et les variations de charge à proximité peuvent « éteindre » le canal9. De plus, les capteurs à base de FET sont généralement fabriqués sur des substrats non transparents (par exemple, du silicium), ce qui les rend inadaptés à une utilisation dans des dispositifs OoC10.

Schéma du dispositif OoC proposé avec détection multimodale intégrée. (a) Croquis de la face avant. Les flèches roses indiquent les connexions électriques pour les FET à grille flottante utilisés pour surveiller les changements de pH, ainsi que l'extension des grilles flottantes utilisées comme microélectrodes pour enregistrer l'activité des cellules électriquement actives. (b) Croquis de l'arrière. Les électrodes sont fabriquées sur la face avant et la membrane polymère est libérée en gravant le silicium de la face arrière, ce qui conduit à une structure semblable à un puits pour loger l'analyte sous test. (c) Croquis d'un capteur avec bornes étiquetées. (d) Schéma du circuit équivalent de l'appareil lorsqu'il est utilisé comme FG-FET. Les capacités dues à la double couche électrique sont représentées par \(C_S\) et \(C_A\) au niveau de la zone de détection. (e) Schéma du principe de fonctionnement du FG-FET. Lorsqu'il y a un changement dans la charge nette à proximité de l'extension FG, le point de fonctionnement du capteur changera. Ce changement peut être détecté en surveillant le courant de drain du transistor.

Comme alternative à ces approches, des FET organiques à modulation de charge (OCMFET) ont été introduits. Ceux-ci sont basés sur des grilles flottantes et sont biocompatibles et transparents, ce qui les rend parfaitement adaptés aux applications de culture cellulaire sur puce9,11,12. Dans ce cas, au lieu d'utiliser l'électrode de référence externe, des grilles flottantes (FG) ont été couplées de manière capacitive à une grille de commande (CG) et utilisées sans appliquer de tension à la borne FG pour régler le point de fonctionnement du transistor. La détection de l'analyte à proximité immédiate de l'extension de l'électrode FG a été réalisée par modulation de charge par rapport à la charge nette, qui à son tour a modifié le point de fonctionnement du transistor. Malgré leur rapport signal/bruit distinctif, les OCMFET nécessitent généralement l'application de valeurs haute tension pour « allumer » le transistor. Ces valeurs pourraient perturber la physiologie des cellules, selon le modèle d'organe. De plus, des modifications du signal de sortie dues à la modulation de charge ont été signalées aux niveaux de nA7,12, attestant d'une faible sensibilité.

Nous présentons ici un dispositif OoC hybride silicium-polymère avec des capacités de détection électriques multimodales (charge et champ) intégrées (Fig. 1). Le dispositif combine les performances électriques supérieures du silicium et la biocompatibilité, la douceur et la transparence des polymères. La puce contient 8 capteurs à base de FG-FET, dont le corps et les bornes reposent sur le cadre périphérique en silicium (Fig. 1a). L'extension des FG passe par-dessus la membrane polymère suspendue centrale, qui constitue la culture tissulaire ainsi que la zone de détection, pour suivre les changements de pH en temps réel (Fig. 1b). Bien que la puce contienne 8 capteurs à base de FET, pour cette étude, un seul des capteurs a été utilisé pour suivre les changements de pH, en raison de la capacité actuelle de la configuration de mesure mobile personnalisée. La petite taille de la puce et en particulier la taille de la zone de détection permet de surveiller les changements dans un petit volume moyen (\(\sim 30\,\upmu \hbox {L}\)). De plus, selon la sélection terminale, des extensions des électrodes FG peuvent être utilisées comme microélectrodes, pour surveiller l'activité des cellules électrogéniques telles que les neurones.

Dans le dispositif présenté ici, les FG n'ont pas de bornes pour appliquer la tension ; ils sont plutôt couplés de manière capacitive à l'environnement et aux grilles de contrôle (CG) (Fig. 1c). La première grille de commande (\(CG_1\)), qui se trouve sur la partie en silicium, spécifie le point de fonctionnement du transistor, tandis que la seconde CG (\(CG_2\) dans le schéma) complète le circuit et se couple à l'électrode- interface électrolytique (Fig. 1d). Un changement de charge net à proximité immédiate de l'extension de grille flottante (également appelée électrode de détection) induit un changement de la tension de seuil du transistor et peut être surveillé comme le changement du courant de drain du transistor ; puisque la modulation de charge sur le FG induit une polarisation correspondante du diélectrique de la grille (Fig. 1e). Ce mécanisme de transduction est détaillé ailleurs9,13 et est également basé sur la polarisation de l'extension. Bien que la polarisation parfaite ne soit pas réalisable expérimentalement, aucun courant ne circule dans l'extension FG, car le FG n'est couplé que de manière capacitive et il n'y a pas de courant de grille de fuite, donc la polarisation est possible14.

Fabrication et conditionnement du dispositif OoC. (a) Principales étapes de fabrication du capteur. L'encart violet montre les dimensions de l'appareil final, ainsi que la section transversale. (b) Face avant de la puce après les étapes de fabrication et le découpage en dés. (c) Image SEM de la puce de l'arrière. (d) Dispositif assemblé et prêt à l'emploi. (e) Schéma de l'assemblage de la puce, avec puits et support imprimés en 3D et le PCB conçu sur mesure avec coupe centrale pour l'accès à l'imagerie optique.

Parmi les organes humains, le cerveau a sans doute la physiologie la plus complexe, composé de nombreux types différents de neurones et de cellules gliales, interagissant les uns avec les autres de manière complexe. La surveillance de l'activité des cellules électriquement actives, principalement des neurones, peut conduire à l'identification de mécanismes neurobiologiques dysfonctionnels sous-jacents aux phénotypes de la maladie. Des chercheurs de domaines interdisciplinaires ont utilisé des électrodes pour des enregistrements in vivo et in vitro de potentiels d'action15 dans diverses configurations, en particulier des réseaux de micro-électrodes (MEA). Les MEA sont généralement mis en œuvre pour enregistrer des centaines de neurones en même temps d'une manière relativement élevée, ce qui s'est avéré être une lecture fonctionnelle robuste pour faire la distinction entre les conditions saines et malades16. En outre, il a également été démontré que les AME conviennent à la découverte et aux tests de médicaments17,18,19,20. Divers types de cellules neuronales et gliales peuvent être cultivés sur des AME et former des réseaux neuronaux complexes. Ces réseaux de neurones peuvent générer des oscillations à différentes fréquences (de 0,05 Hz jusqu'à des centaines de Hz21). Différents types de dispositifs MEA existent, notamment des électrodes jetables22, 3D avec stimulation optique23 et des MEA statiques intégrés à la spectroscopie d'impédance dans un dispositif microfluidique24 pour optimiser l'extraction du signal. Ici, nous utilisons l'extension des électrodes FG comme microélectrodes passives, pour pouvoir utiliser notre puce comme dispositif MEA, en plus de la détection de charge déjà décrite.

La reproductibilité et la normalisation dans la fabrication de dispositifs OoC sont cruciales pour des modèles d'organes robustes. Par conséquent, des méthodes de fabrication en salle blanche au niveau de la tranche basées sur BiCMOS ont été utilisées pour fabriquer des lots de puces nominalement identiques25. Le flux de fabrication est expliqué en détail dans la section "Méthodes", et les principales étapes sont illustrées à la Fig. 2a. La petite taille des puces est visible de face (Fig. 2b) et de face (Fig. 2c). Pour faciliter la manipulation des liquides au niveau de la zone de détection, un support imprimé en 3D et un puits ont été assemblés au-dessus de la puce (Fig. 2d). De plus, des cartes de circuits imprimés (PCB) conçues sur mesure et compatibles avec les systèmes de lecture à matrice de microélectrodes disponibles dans le commerce ont été conçues pour compléter l'emballage des dispositifs (Fig. 2e). Cet emballage rend les puces conformes à l'infrastructure de laboratoire existante et directement utilisables pour les enregistrements de potentiel d'action de cellules électriquement actives sans nécessiter de connaissances techniques supplémentaires de la part de l'utilisateur final. De plus, un analyseur de lecture électronique compact et mobile sur mesure a été développé pour améliorer la portabilité de l'appareil et pour pouvoir utiliser des capteurs FG-FET dans des environnements pertinents, par exemple des incubateurs à \(37\,\,^ {\circ}C\) et \(5\%\) \(CO_2\).

L'un des signaux biochimiques les plus importants à surveiller pendant la culture cellulaire est le pH, car les changements de pH peuvent être causés par des produits du métabolisme cellulaire. Ainsi, le pH est un indicateur de la viabilité des cellules, ainsi que de certains phénotypes pathologiques9,26, car il est lié au taux d'acidification du milieu27.

Le pH est une mesure de la concentration des ions hydrogène (\(H^+\), c'est-à-dire des protons), qui est ici modélisée comme la charge nette. Divers modèles pour examiner la charge des surfaces ont été développés au cours des dernières décennies, ici nous utilisons la double couche électrique (EDL) et la liaison de surface des espèces chargées28,29. Ce modèle est basé à la fois sur la théorie de la liaison de site et sur la capacité électrique à double couche30. Dans notre modèle, les paramètres MOSFET pertinents ont été extraits des mesures à sec des capteurs avec Advanced Design System (ADS), implémentés dans un code Matlab personnalisé et couplés aux équations de la double couche électrique. Les équations de la dynamique de la grille flottante et de la double couche électrique qui se forme en raison de l'électrolyte ont ensuite été résolues.

En théorie, puisqu'il n'y a pas d'application directe de tension au FG, la charge piégée dans le FG devrait rester constante. A partir du principe de conservation des charges, une relation de charge peut être établie7,9,12,14. La tension FG et, par conséquent, la variation du courant de drain dépendent de trois variables. La première variable est la charge de surface (\(\sigma _S\)) due à l'interface électrolyte-électrode couplée à \(CG_2\), qui impacte le potentiel de surface au niveau de la zone de détection (\(\Psi _0\)). Cela induit un potentiel \(\Psi _S\) = \(-\Psi _0\) à travers le métal sous la couche d'oxyde au niveau de la zone de détection. La deuxième variable est liée à la charge piégée à l'intérieur du FG (\(Q_0\)), et la dernière variable dépend de \(CG_1\)(Eq. 1). Le couplage de \(CG_2\) à travers la membrane PDMS au FG a également été inclus dans l'équation, bien que \(C_{PDMS}\) ait été calculé comme étant de l'ordre de \(\approx 10^{-16}F\ ), et donc négligeable. Ces sources sont additionnées pour le résultat final pour la tension FG (Fig. 1d). De plus, la deuxième porte de contrôle peut être considérée comme une pseudo-électrode de référence, intégrée au moyen du flux de fabrication planaire en salle blanche (Fig. 2a). En conséquence, tous les éléments du circuit contribuent à la tension FG comme la somme des couplages capacitifs31 :

Le \(CG_{2}\) (illustré à la Fig. 1d) module le potentiel à la surface de détection. La capacité totale \(C_{tot}\) comprend la capacité parasite entre le FG et le corps en silicium, \(C_{CB}\), la capacité de la membrane PDMS, \(C_{PDMS}\) et la capacité respectivement de la surface sensible et des \(CG_1\), \(C_S\) et \(C_{C G_1}\). Le potentiel à la surface de détection \(\Psi _S\) dépend de \(V_{FG}\), le potentiel à l'EDL \(\Psi _A\) et les charges de surface correspondantes \(\sigma _S\) et \(\sigma _A\) (Voir la section "Méthode" pour plus de détails). Le courant de drain dans la région de saturation peut être calculé à partir des changements de tension de seuil :

Où \(\beta\) est un paramètre d'ajustement qui est inclus après les résultats expérimentaux (expliqués dans la section suivante) et \(\alpha\) est la constante associée aux caractéristiques du transistor :

La liaison de différents ions et molécules d'eau polaires sur la surface peut être réalisée de différentes manières en fonction des différents matériaux. Dans le code Matlab, nous avons caractérisé le potentiel de surface au niveau de la zone de détection pour différentes constantes de dissociation de surface et l'avons implémenté à la tension du FG et donc au courant de drain (Fig. 3a). Le changement de pH module la formation de charge de surface, et donc le changement de potentiel à l'EDL et à la surface de détection. Ces changements modulent le décalage de la tension de seuil et le courant de drain du FET.

(a) Modèle analytique du capteur avec différentes constantes de dissociation. Le tracé 3D montre le changement de potentiel à l'EDL par rapport à différentes constantes de pH et de dissociation, et le changement résultant du courant de drain. Expériences avec des liquides d'étalonnage du pH : (b) Configuration de détection du pH en temps réel. L'unité de mesure mobile a été connectée à la puce sous test et le \(I_D\) résultant a été surveillé via une connexion Bluetooth sur l'ordinateur. (c) Surveillance continue des changements de pH (rose = pH 4, vert = pH 7, bleu = pH 9). L'enregistrement montre un décalage de courant de drain plus élevé lorsque la valeur initiale est plus élevée par rapport aux autres signaux affichés sur le tracé. (d) Test de saturation sur puce. Des solutions à pH 4 et pH 9 de volumes égaux ont été ajoutées séquentiellement sans rinçage intermédiaire. Les valeurs \(I_D\) résultantes sont cohérentes les unes avec les autres, car le pH résultant pour les 3 événements est le même. (e) Comparaison entre la solution analytique et les données expérimentales pour le capteur représenté en (c). Le « X » représente la valeur moyenne de l'ensemble de données expérimentales pour chaque solution de pH testée. (f) Analyse de sensibilité avec de petits incréments de pH. La flèche représente l'augmentation de l'acidification due à l'ajout séquentiel de liquide à pH 4. Les pointes vers le bas proviennent de l'impact du liquide supplémentaire sur la zone de détection.

La caractérisation sèche des FET a été décrite ailleurs25. Pour la surveillance en temps réel des différentes valeurs de pH, la couche native de TiO2 sur les électrodes a été utilisée comme couche sélective et une unité de mesure compacte et mobile a été développée (voir la section "Méthodes"). Cette unité fournit une configuration compacte pour la mesure en temps réel et continue. La portabilité et la compacité sont importantes car pour les OoC, l'environnement de mesure peut être un incubateur dans un laboratoire de biologie cellulaire, où l'équipement de lecture externe n'est pas courant, indésirable et doit donc être minimisé (Fig. 3b). Avant d'introduire les liquides d'étalonnage du pH, la puce a été rincée avec de l'eau déminéralisée (DI) puis séchée. Cependant, une fine couche de molécules d'eau devrait rester à la surface en raison de la liaison de surface. Ceci peut être considéré comme l'état initial du capteur (Fig. 3c, bande noire). Ensuite, des liquides tampons marqués avec différentes valeurs de pH (4, 7 et 9, AVS TITRINORM, BDH Chemicals) ont été introduits dans la zone de détection, à l'aide d'une micro-pipette (\(\approx \,30\, \upmu\ )L). L'ordre d'introduction des liquides était aléatoire, pour montrer la reproductibilité du capteur sous test. À travers des mesures consécutives, les données ont montré une réversibilité élevée du capteur, ce qui signifie qu'après le retrait de la solution et le rinçage avec de l'eau DI, le capteur est revenu à son état initial en quelques secondes, pour l'introduction du liquide suivant (Fig. 3c). Après chaque mesure, le liquide testé a été retiré de la zone de détection avec une micropipette et la puce a été rincée avec de l'eau DI pour réinitialiser la lecture du capteur à sa ligne de base. Les pointes causées par la manipulation de l'eau DI entre les événements peuvent être observées sur la figure 3c. Le temps de réponse moyen du capteur était de 5,48 s avec un écart type de 1,3 s à partir de 15 mesures (Informations supplémentaires, Fig. S1). Tout en surveillant les mesures, le temps de réponse du capteur a été calculé à partir des instants où les lectures étaient stables, avant et après la mise à jour du pH de la solution (Informations supplémentaires, Fig. S2) et les valeurs moyennes et d'écart type ont été indiquées dans Informations supplémentaires, figure S3. Pour la préparation du jeu de données d'étalonnage du capteur avec des valeurs de pH connues, nous n'avons pas recirculé le tampon, pour éviter toute contamination. Cependant, il pourrait être utile d'envisager la recirculation après avoir construit l'ensemble de données d'étalonnage des valeurs de pH connues. Ici, nous avons choisi un appareil de type n (nMOS), avec \(V_{CG} = 5V,\) \(V_{DS} = 3V,\) \(V_{SUB} = V_S = 0V\) et \ ({V_{CG_2}} = 3,3 V.\) On a observé que les valeurs de courant de drain diminuaient avec l'augmentation de l'acidité, ce qui est cohérent avec la littérature7, où pour un dispositif organique de type p, la même tendance dans la direction opposée a été signalée. Nous supposons que le décalage plus élevé par rapport aux valeurs de pH inférieures provient de la polarisation de la couche d'oxyde de détection, détectant la charge opposée de la couche formée réelle. À partir des données expérimentales, nous concluons que les valeurs de courant de drain correspondant à différents liquides de pH (4, 7 et 9) pourraient être mesurées avec quelques secondes de temps de réponse (Informations supplémentaires Fig. S1). À partir des données mesurées, une valeur de sensibilité \(\frac{\Delta I_{D}}{\Delta pH}\) a été obtenue comme \(1.5305\frac{\mu A}{pH}\) pour le changement entre le pH 7 et pH 9 et \(1.3574\frac{\mu A}{pH}\) entre pH 7 et pH 4.

Pour tester la saturation de l'appareil, sans rincer la zone de détection, le tampon pH 9 a été ajouté après le tampon pH 4 à volume égal. Dès le premier événement de la Fig. 3d, nous avons observé que lorsque le tampon pH 4 était introduit, l'augmentation du courant due à l'ajout du tampon pH 9 était plus faible, probablement en raison du fait que la surface de la zone de détection était déjà principalement recouvert d'ions H+ provenant de la solution à pH 4. Lorsque la zone de détection a été nettoyée et que le tampon pH 9 a été introduit en premier (deuxième et troisième événement), le \(I_D\) initial a augmenté, puis a diminué avec l'ajout d'un tampon pH 4, même si le décalage de \(I_D\) était plus faible lorsque le capteur était en parfait état avant l'introduction du liquide. Les valeurs \(I_D\) résultantes étaient cohérentes avec les 3 événements pour le même pH final (Fig. 3d, bande violette). Pour la détection du pH, nous avons utilisé le \(TiO_2\) natif pour servir de couche sélective32, et les constantes de dissociation de surface \(pK_A = 8\) et \(pK_B = 4,5\)29,33 pour comparer les résultats expérimentaux avec le modèle analytique (Fig. 3e). Nous avons constaté la même tendance pour les valeurs de courant de drain à la fois pour les calculs analytiques et les expériences (tableau d'informations supplémentaires 1). Un paramètre d'ajustement (\(\beta = 30\) \(10^{-6}\)A) a été introduit dans le modèle et additionné aux valeurs de courant de drain pour tenir compte des paramètres inconnus, c'est-à-dire la capacité de la couche Stern due à la double couche électrique (calculée comme étant \(C_{Stern} = 1,078 \cdot 10^{-11}F\) avec les hypothèses basées sur28), l'épaisseur réelle du \(TiO_2\) natif et la charge piégée à l'intérieur de la FG.

Enfin, en utilisant un autre n-MOS FG-FET sur une puce séparée, de plus petits changements de pH ont été enregistrés par addition séquentielle de 2 et 3 \(\upmu \hbox {L}\) de tampon pH 4 (diminuant le pH initial du liquide à 4.4 et 4.3, respectivement) sans rincer la zone de détection (Fig. 3f). Ce test a montré la sensibilité du capteur pour détecter de petits (0,1) changements de pH en solution. Les limites inférieures doivent être étudiées plus en détail avec une configuration de mesure avec une résolution de courant inférieure à nA, actuellement indisponible pour notre solution portable.

Comme preuve de concept du capteur, nous utilisons des neurones corticaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) et montrons la capacité du capteur à enregistrer leur activité potentielle d'action de manière extracellulaire. À cette fin, nous avons introduit et utilisé la picrotoxine, un antagoniste \(GABA_A\) non compétitif, pour induire un comportement de type rafale dans notre culture cellulaire qui peut être détecté à l'aide de la puce MEA. Avant d'enregistrer l'activité de dopage extracellulaire, la biocompatibilité de la puce a été testée. Les cellules progénitrices neurales (NPC) ont été différenciées pendant 7 jours et mûries pendant 2 semaines sur la puce avant que les cellules ne soient fixées et colorées. La coloration a montré un marqueur neuronal mature (\(\beta 3\) tubuline/vert) ainsi que la production de vésicules synaptiques (synaptophysine/rouge). La maturation réussie des neurones corticaux dérivés de hiPSC a confirmé la biocompatibilité des puces pour les mesures en direct et non invasives (Fig. 4a, b).

Pour l'enregistrement de l'activité de pointe extracellulaire, nous avons utilisé la configuration de lecture de Multichannel Systems (MCS), qui est un système disponible dans le commerce et couramment utilisé pour les mesures d'électrophysiologie dans les laboratoires (Fig. 4c). La raison était de démontrer la compatibilité avec un système de lecture standardisé et la capacité de notre puce à être utilisée dans n'importe quel laboratoire avec cet équipement, sans avoir besoin de connaissances de base supplémentaires de l'utilisateur final. Nous avons conçu un circuit imprimé compatible avec la configuration de lecture MCS pour le modèle MEA à 60 électrodes. L'inclusion d'une ouverture au centre du PCB permet aux utilisateurs finaux d'avoir une visibilité sur la culture cellulaire grâce à la membrane PDMS transparente (Fig. 4d).

Nous avons enregistré des signaux électrophysiologiques spontanés de neurones corticaux dérivés de hiPSC à partir d'une microélectrode, comme preuve de concept. D'après le post-traitement du signal enregistré, la cadence de tir moyenne était de 0,9661 Hz. La picrotoxine a été ajoutée à la culture cellulaire, pour induire une condition semblable à l'épilepsie dans la culture cellulaire34 et pour déterminer si la puce pouvait mesurer les changements dans le signal électrophysiologique des neurones. Nous avons introduit la picrotoxine (50 \(\upmu \hbox {M}\)) 20 s après le début des enregistrements, comme on peut le voir sur la Fig. 4e-ligne bleue. La figure 4f montre un canal représentatif qui a été enregistré, et il a été montré que la cadence de tir a été augmentée en moyenne (N = 3) de 0,31 ± 0,1 Hz avant l'ajout de la picrotoxine à 1,38 ± 0,25 Hz après l'ajout du médicament. La production de signal résultante à partir des neurones dérivés de hiPSC vus sur la figure 4f avec un événement de type rafale (insert "après la picrotoxine") est représentative de l'exposition à la picrotoxine.

Expériences de biocompatibilité et de preuve de concept électrophysiologique : (a, b) Neurones corticaux dérivés de HiPSC différenciés (7 jours) et mûris (14 jours) sur puce. Après coloration, les neurones positifs à la tubuline \(\beta 3\) (vert) et les vésicules synaptiques (rouge) sont visibles. (c) Compatibilité avec la configuration d'enregistrement MEA des systèmes multicanaux du PCB et de la puce. (d) Encart montrant la puce et le puits avec le milieu et les cellules. ( e ) Signal de trace à une électrode des enregistrements MEA. (f) L'ajout de picrotoxine (50 \(\upmu \hbox {M}\)) a provoqué une augmentation de la cadence de tir.

Nous avons montré la capacité du capteur à base de FG-FET à mesurer les changements locaux de pH et les enregistrements de potentiel d'action extracellulaire sur puce.

Notre capteur de pH a révélé la répétabilité de la détection tout en changeant consécutivement le liquide sous test, sans saturer les électrodes de détection pendant des périodes de mesure d'une heure. Il est possible d'identifier la valeur du pH des liquides grâce à leurs empreintes distinctives de courant de drain (Fig. 3d). Selon la largeur et la longueur des canaux des FET, différentes valeurs initiales de tension de seuil ont été obtenues. La différence dans les valeurs initiales du courant de drain est causée par des dimensions de grille différentes et des défauts possibles qui pourraient survenir pendant la fabrication. L'étalonnage de chaque FET avec des liquides tampons pH serait nécessaire pour obtenir l'empreinte digitale du capteur, avant de tester les liquides dans des environnements physiologiquement pertinents. Pour les expériences, après avoir mesuré le point de fonctionnement initial du FET, les valeurs des changements de pH ont été surveillées. Des mesures simultanées à partir de plusieurs électrodes à la fois peuvent induire une diaphonie entre les électrodes et un bruit supplémentaire, détériorant le rapport signal sur bruit. Une couche d'isolation électrique d'anneau de garde35 peut être ajoutée lors de la fabrication du dispositif, pour assurer la suppression d'éventuelles diaphonies entre des environnements cellulaires proches.

Les FG-FET à modulation de charge sont très prometteurs, même si les charges piégées dans le FG sont très petites à manipuler sans l'utilisation d'une électrode de référence (ou pseudo-électrode). Si nécessaire, l'application d'une tension avant les expériences directement sur le FG augmenterait les charges piégées à l'intérieur et entraînerait donc une modification plus importante de la tension de seuil. Lorsque notre capteur hybride silicium-polymère est comparé à l'art antérieur7,12, nous utilisons des valeurs de tension plus faibles et obtenons des changements de courant plus élevés (\(\upmu \hbox {A}\) plutôt que nA), ce qui pourrait augmenter la viabilité de la cellule cultures où de longues périodes de culture sont nécessaires pour examiner divers phénotypes testés. De plus, le processus de fabrication en salle blanche à l'échelle de la plaquette permet une précision, une reproductibilité et un rendement plus élevés des capteurs, et permet d'intégrer plusieurs matériaux et des circuits plus complexes dans les dispositifs OoC, si vous le souhaitez. Dans notre dispositif, la zone de détection et les bornes électroniques sont isolées les unes des autres. Par conséquent, sans modifier les matériaux intrinsèques (par exemple, l'oxyde de grille) des transistors, des revêtements sélectifs peuvent être appliqués en tant qu'étape de post-traitement36. Cette étape de post-traitement permet de réaliser différents capteurs de charge ou d'affinité.

Comme preuve de concept, nous avons utilisé ici un faible nombre d'électrodes d'enregistrement. Cependant, en raison des capacités de traitement en salle blanche, le nombre de microélectrodes peut être augmenté sans compromettre la petite surface de la puce (1 \(\hbox {cm}^2\)). Le bruit qui peut être couplé aux enregistrements des potentiels d'action extracellulaires est majoritairement thermique15.

L'activité des réseaux neuronaux peut être enregistrée à différentes fréquences, en fonction des informations que l'on souhaite examiner. Pour le capteur de pH, un taux d'échantillonnage de 1 Hz a été choisi. Bien que les événements de potentiel d'action se produisent généralement à des fréquences plus élevées, la même configuration sans modifications peut également être utilisée pour l'électrophysiologie. L'activité électrophysiologique spontanée des neurones corticaux dérivés de hiPSC a été mesurée avec succès sur puce et selon les besoins, il est également possible d'enregistrer des potentiels de champ locaux. Étant donné que les électrodes qui ont été utilisées pour cette étude sont relativement grandes par rapport à la taille typique des cellules (différentes tailles, jusqu'à 100 \(\upmu \hbox {m}\)), elles pourraient être de bons candidats pour le champ local à basse fréquence. enregistrements potentiels. En raison du bruit \(1/f^2\), des électrodes plus grandes sont plus favorables15. De plus, les différences de potentiel sur les terminaux \(CG_2\) et FG peuvent améliorer le champ électrique et pourraient être utilisées pour examiner la croissance directionnelle des neurites37 et peut-être même déterminer la direction dans laquelle les axones se développeront. Des études de galvanotropisme ont montré qu'il est possible de guider la croissance des axones en fonction de l'intensité du champ. Cela pourrait être une approche plus naturelle par opposition à l'utilisation d'indices topographiques tels que des rainures pour diriger les axones afin d'imiter, par exemple, l'organisation spatiale comme on le voit dans le cortex des modèles de cerveau sur puce38,39,40.

Bien que nous ayons montré séparément le principe de fonctionnement de l'appareil pour les deux modes de détection, à savoir, le suivi du courant de drain des FET pour distinguer les liquides avec différentes valeurs de pH, et les enregistrements du potentiel d'action extracellulaire, à l'avenir, les mesures peuvent être exploitées simultanément sur la même puce, pour surveiller à la fois l'activité électrique et les changements de pH dans des conditions physiologiquement pertinentes. La bimodalité du capteur intégré révélerait des mesures simultanées du changement de concentration de charge dans les médias et des potentiels d'action externes des cellules, ce qui pourrait révéler des informations pertinentes sur certains phénotypes de maladies et la viabilité des cellules, sans qu'il soit nécessaire de transférer les médias pour analyser sur un module différent. Les mesures en temps réel du changement de pH des milieux cellulaires réels au fil du temps font également partie des travaux futurs. Enfin, la puce peut facilement être intégrée dans des plates-formes OoC, telles que la plate-forme translationnelle d'organes sur puce (TOP)41, en raison de sa compacité et de l'utilisation de la configuration de mesure mobile. Cela faciliterait l'étude de plusieurs modules d'organes et la surveillance de plusieurs signaux biologiques avec la carte microfluidique qui peut être modélisée pour différents gradients42 et programmée pour la manipulation de fluides et les essais biochimiques43.

Le dispositif est fabriqué au moyen d'un flux de processus compatible CMOS au niveau de la tranche. Une tranche de Si de type p polie double face de 4 pouces et de 525 \(\upmu\)m d'épaisseur a été utilisée pour la fabrication de capteurs nMOS à l'aide d'un processus BiCMOS standard. Après avoir défini les bornes de source et de drain par implantation ionique, une couche d'oxyde de grille de 100 nm d'épaisseur a été thermiquement développée. Une couche d'oxyde de 6 \ (\ upmu \) m d'épaisseur a été déposée par dépôt chimique en phase vapeur assisté par plasma (PECVD) et modelée sur la face arrière de la plaquette en tant que masque dur de gravure (Fig. 2a, 1). Une couche de 1 \(\upmu \hbox {m}\) d'épaisseur de \(Al/1\%\)Si a été pulvérisée et modelée sur la face avant pour mettre en œuvre des interconnexions électriques et des grilles flottantes (Fig. 2a, 2). Une couche d'oxyde PECVD de 150 nm d'épaisseur a été utilisée comme diélectrique entre les électrodes CG et FG. Le polyimide (PI, Fujifilm LTC9305, Europe NV, Belgique) a ensuite été enduit par centrifugation et modelé en tant que couche de transition isolante et mécanique pour couvrir la majeure partie de l'extension de la grille flottante sur la région de détection OoC (Fig. 2a, 3). Une couche de Ti de 300 nm d'épaisseur pulvérisée a été conçue pour servir d'extensions CG et FG, ainsi que les microélectrodes utilisées pour les enregistrements de potentiel d'action (Fig. 2a, 4). Le polydiméthylsiloxane (PDMS, Sylgrad 184, Dow Corning, Midland, MI, USA) a été mélangé avec son agent de durcissement dans un rapport de 10:1, dégazé, enduit par centrifugation et durci pour servir de membrane de 20 \(\upmu\)m d'épaisseur pour la zone de culture cellulaire/détection de charge OoC. Un AlSi de 200 nm d'épaisseur a été pulvérisé pour servir de couche de protection sur la membrane PDMS, qui a ensuite été libérée en gravant le substrat en Si par l'arrière par gravure ionique réactive profonde (Fig. 2a, 5). La plaquette a finalement été découpée en 52 puces carrées égales avec une empreinte de 1 \(\hbox {cm}^2\). Un support imprimé en 3D (MOIIN Tech Clear Resin, Hambourg, Allemagne) a ensuite été monté et les puces ont été liées par fil à des PCB conçus sur mesure. En fonction de la borne de contact électrique sur l'appareil, les capteurs peuvent être utilisés comme capteur de charge à base de FET ou microélectrode pour capturer les événements de potentiel d'action des cellules électriquement actives. Enfin, des puits imprimés en 3D (diamètre = 6 mm, hauteur = 7 mm) (MOIIN Tech Clear Resin) ont été collés avec du PDMS sur la zone de détection pour faciliter la manipulation des liquides (Fig. 2b).

Pour analyser le FG-FET, le système d'équations gouvernantes est résolu dans Matlab. Ces équations résolvent le potentiel à la grille flottante \(V_{FG}\), le potentiel à la surface de détection \(\Psi _S\) et l'EDL \(\Psi _{A}\), et les charges de surface correspondantes \( \sigma _S\) et \(\sigma _{A}\)12.

Le potentiel à la double couche affecte la charge de surface \(\Psi _S\) et corrèle le potentiel global de la solution (\(V_{B ulk}\), supposé être le même que la tension appliquée depuis \(CG_2\) ) à la surface. De plus, \(CG_2\) modifie le potentiel à l'EDL au-dessus de la surface de détection :

La capacité due à \(CG_2\) a été calculée en supposant une autre couche Stern due à l'interface électrolyte-électrode et sa couche native de TiO2. La charge de surface due aux groupes hydroxyle à la surface de l'oxyde est liée au nombre de sites de liaison \(N_s\) et aux constantes de dissociation de surface \(K_*\) :

La variation de la tension de seuil apparaît à partir de la charge nette à la surface de détection (\(Q_S\)) et de la tension de seuil initiale, qui est obtenue à partir du CG :

Ce système d'équations a été utilisé pour calculer le comportement du capteur à base de FG-FET pour différentes valeurs de pH et de constante de dissociation.

Pour la détection du pH, une configuration de mesure mobile a été développée (Fig. 3c). Le dispositif comprend une carte de détection pour polariser le FET à grille flottante et convertir le signal de courant de sortie en tension (ajusté via des résistances commutables pour détecter même dans la plage nA). De plus, un convertisseur analogique-numérique (ADC) 18 bits a été utilisé pour convertir les valeurs de tension en un code numérique, et la transmission du signal a été mise en œuvre via Bluetooth Low Energy. Le signal de sortie a été contrôlé par un script MATLAB ainsi que par un appareil Android.

La lignée hiPSC LUMC0114iCTRL01 (numéro hPSCreg LUMCi003-A)44 a été utilisée pour dériver des cellules progénitrices neurales (NPC) à l'aide du kit STEMdiff SMADi Neural Induction (05835, StemCell Technologies). La puce a été traitée au plasma (50 W, 50 KHz, 45 s avec le système plasma CUTE de Femto Science, Selangor, Malaisie) avant d'être recouverte de Poly-L-Ornithine (P3655, Sigma Aldrich) avec une concentration de 100 \(\upmu \)g/mL et incubé à température ambiante (TA) pendant la nuit. Le lendemain, la puce a été incubée à \(4\,\,^{\circ }\hbox {C}\) pendant 30 min avant un revêtement de laminine (\(200\,\frac{\upmu \hbox {g} }{\hbox {mL}}\)) a été appliqué. Après quoi la puce a été incubée à \(37\,\,^{\circ }\hbox{C}\) pendant 2 h. Les PNJ ont été ensemencés à une concentration de 100 000 cellules \(\cdot \hbox {cm}^{-2}\) sur la puce et ont ensuite été différenciés en neurones corticaux pendant 7 jours à l'aide du kit de différenciation des neurones du cerveau moyen STEMdiff (100-0038, Technologies des cellules souches). Enfin, les neurones corticaux dérivés de hiPSC ont été mûris et maintenus dans le support du kit BrainPhys hiPSC Neuron (05795, StemCell Technologies) pour le reste de l'expérience. Tous les milieux ont été additionnés de \(1 \%\) pénicilline/streptovidine. Pour les expériences médicamenteuses, pour bloquer l'inhibition, la picrotoxine (P1675-1G, Sigma Aldrich) a été préparée à une concentration de 50 \(\upmu \hbox {M}\) dans du milieu BrainPhys et a été ajoutée 20 secondes après le début des enregistrements.

Le système MEA2100 (Multi Channel Systems, Reutlingen, Allemagne) a été utilisé pour enregistrer l'activité électrophysiologique des neurones sur puce avec la phase de chauffage réglée sur \(37\,\,^{\circ }\hbox{C}\). Plusieurs enregistrements de 1 min à 10 kHz ont été effectués à 21 jours in vitro (DIV) (c'est-à-dire 7 jours de différenciation et 14 jours de maturation). Les données ont été collectées avec un filtre passe-haut Butterworth avec une fréquence de coupure de 200 Hz. Les fichiers d'enregistrement bruts (.msrd) ont été obtenus à partir du système MEA2100 et ont été convertis en fichiers HDF5 à l'aide du logiciel MCS. Nous avons utilisé MEA-ToolBox45 pour analyser les données MEA dans MATLAB 2018b (Mathworks, Massachusetts, USA). MEA-ToolBox a été fixé au seuil \(5 \cdot RMS\) pour la détection des pointes et la moyenne a été calculée à partir de 3 enregistrements.

Les neurones corticaux dérivés de hiPSC ont été fixés à DIV 21 dans \(4 \%\) paraformaldéhyde pendant 20 min à température ambiante (TA) et perméabilisés avec \(1 \%\) Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, Sigma-Aldrich) pendant 20 min. Après l'étape de perméabilisation, les cellules ont été lavées trois fois dans du PBS pendant 5 min chacune à température ambiante. Les cellules ont ensuite été incubées avec de l'albumine de sérum bovin \(1 \%\) (BSA ; n° 9048468, SigmaAldrich) pendant 30 min pour bloquer la liaison non spécifique, puis lavées à nouveau dans du PBS trois fois pendant 5 min chacune à température ambiante. Les principaux anticorps utilisés étaient la \(\beta 3\) tubuline (polyclonal de lapin PA5-86069, Thermofisher, Waltham, MA, USA), la synaptophysine (monoclonal de souris ab8049, Abcam, Cambridge, UK). Ces anticorps primaires ont été dilués au 1/200 dans \(1\%\) BSA dans du dPBS (ne contient pas de magnésium et de calcium) et incubés pendant 1 h à température ambiante. Les anticorps secondaires étaient Texas red (Goat anti-mouse, ab7066, Abcam) et Alexa Fluor®488 nm (Goat anti-rabbit, ab150077, Abcam) qui ont été dilués au 1 : 500 dans \(1 \%\) BSA dans dPBS. Ces anticorps secondaires ont été incubés pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité avant d'être lavés avec du PBS trois fois pendant 5 min chacun. Les noyaux cellulaires ont été colorés à l'aide de NucBlue (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) pendant 20 min. Les images fluorescentes ont été prises à l'aide d'un système de microscope Keyence BZ-810 (Osaka, Japon).

Les ensembles de données générés au cours de l'étude actuelle sont disponibles auprès de l'auteur correspondant. Les ensembles de données analysés sont inclus dans cet article publié.

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Les auteurs tiennent à remercier le personnel du laboratoire Else Kooi de la TU Delft pour leur soutien. Ce travail a été soutenu par la Netherlands Organ-on-Chip Initiative, un projet de gravitation NWO financé par le ministère de l'Éducation, de la Culture et des Sciences du gouvernement des Pays-Bas (024.003.001).

ECTM, Département de microélectronique, Université de technologie de Delft, Delft, 2628 CD, Pays-Bas

Hande Aydogmus, Lovro Ivancevic, Pasqualina M. Sarro & Massimo Mastrangeli

Département de génétique humaine, Centre médical universitaire de Leiden, 2333 ZC, Leiden, Pays-Bas

Michel Hu, Jean-Philippe Frimat & Arn MJM van den Maagdenberg

Département de neurologie, Centre médical universitaire de Leiden, 2333 ZC, Leiden, Pays-Bas

Michel Hu, Jean-Philippe Frimat & Arn MJM van den Maagdenberg

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MM et HA ont proposé et conçu la recherche et rédigé le manuscrit. LI a développé le système de mesure mobile. HA a fabriqué le dispositif et effectué des caractérisations électriques. JPF et MH ont réalisé toutes les expériences de culture cellulaire et enregistré et analysé les données MEA. JPF et MH ont également contribué à la rédaction de la section d'électrophysiologie et ont commenté le manuscrit. AMJMvdM, PMS et MM ont commenté le manuscrit et fourni des informations supplémentaires. Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit.

Correspondance avec Hande Aydogmus.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Aydogmus, H., Hu, M., Ivancevic, L. et al. Un dispositif d'organe sur puce avec des capteurs de charge intégrés et des microélectrodes d'enregistrement. Sci Rep 13, 8062 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34786-5

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Reçu : 04 août 2022

Accepté : 08 mai 2023

Publié: 18 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34786-5

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